【摘要】：次生代謝物以及一些營養(yǎng)元素的穩(wěn)態(tài)是植物學研究的焦點,也是農作物抗逆性及營養(yǎng)品質改良關注的焦點。類黃酮是植物體內最重要的次生代謝物之一,但是目前我們對類黃酮比如異黃酮、花青素和原花青素在豆科植物特別是大豆中的轉運機制知之甚少。豆科植物比如大豆和蒺藜苜蓿在防衛(wèi)病原菌或者共生固氮過程中會分泌一些特定的異黃酮,比如植保素phytoalexins、genistein或者daidzein,這些化合物通常被分泌到病原菌侵染部位或者根際。目前關于豆科植物的根向外分泌異黃酮的機制尚不明確。黑豆的種皮中積累了大量的包括花青素和原花青素在內的類黃酮色素,此前有關黑色大豆種皮顏色相關遺傳位點的解析有過一些報道,但是幾乎沒有研究關注到大豆種子中花青素以及原花青素等類黃酮的轉運機制。鐵是植物必需的微量元素,鐵的穩(wěn)態(tài)通常都與代謝物的轉運有關,但是目前我們對豆科植物中有關這一機制認識仍不清晰。本研究主要探索轉運蛋白在豆科植物類黃酮轉運以及鐵元素穩(wěn)態(tài)調節(jié)放面的功能,主要研究結果如下:本研究通過進化和基因表達數(shù)據(jù)基礎上比較分析蒺藜苜蓿和大豆根中受真菌激發(fā)的轉運蛋白基因,再結合生化實驗,初步確定ABCG轉運蛋白可能與液泡或質膜向外轉運異黃酮有關。隨后本研究從大豆ABCG轉運蛋白一個亞組中鑒定出一個在真菌激發(fā)子誘導下可能參與daidzein和genistein轉運的轉運蛋白GmABCG18。GmABCG18在大豆根中表達水平較高且在真菌激發(fā)子處理以及根瘤菌侵染下表達水平上調。GmABCG18過表達大豆轉基因嵌合體導致發(fā)根分泌物中異黃酮daidzein和genistein的含量增加并且在一定程度上增加了轉基因嵌合體的根瘤數(shù)目,利用RNAi技術沉默GmABCG18則出現(xiàn)相反的情況。在應答根瘤菌侵染時,GmABCG18與其它幾個大豆根瘤形成信號早期基因的表達水平很快升高;這些根瘤形成早期基因的表達在GmABCG18過表達或者被沉默發(fā)根中的表達水平也發(fā)生了改變。因此,本研究認為GmABCG18參與大豆結瘤信號物質daidzein和genistein的分泌,并且它在大豆根-根瘤菌互作以及后續(xù)根瘤形成過程發(fā)揮重要作用。這一研究為進一步理解ABCG轉運蛋白在調節(jié)大豆根信號類異黃酮分泌以及共生固氮過程中的作用提供了新的思路。本研究通過與已知類黃酮轉運蛋白的進化分析初步確定了幾個與花青素、原花青素轉運有關候選基因,這些基因包括三個谷胱甘肽轉移酶GST,以及兩個MATE轉運蛋白,并通過轉化擬南芥同源基因突變體驗證了它們的功能。本研究將三個GST基因轉入擬南芥突變體tt19過表達以后,發(fā)現(xiàn)三個GST的功能是有差異的,GmGSTF8不僅互補了成熟種子因原花青素缺失導致的表型,而且能夠互補突變體幼苗花青素缺失的表型,說明GmGSTF8的功能與擬南芥TT19類似;而GmGSTF11能夠恢復突變體花青素的積累,但是只能部分恢復突變體成熟種子的表型;在蔗糖誘導下,GmGST13只能輕微恢復突變體花青素的含量水平。而大豆兩個MATE轉運蛋白MtMATE60和MtMATE117在功能上是接近的。本研究中比較了兩個大豆MATE轉運蛋白基因過表達擬南芥突變體pab1和fft的表型,發(fā)現(xiàn)這兩個MATE轉運蛋白過表達突變體fft以后,擬南芥種子發(fā)育早期花青素積累增加,說明這兩個轉運蛋白都與未成熟種子中花青素的積累有關。釕紅染色顯示突變體fft的黏液層出現(xiàn)缺損,而突變體pab1和fft成熟種子的大小也發(fā)生了改變,雙突變體pab1的種子表現(xiàn)出不規(guī)則形狀(此前尚無研究關注到這一點);將兩個MATE轉運蛋白在兩個擬南芥突變體中表達以后,這些表型異常的種子都恢復到了正常的狀態(tài)。這一研究為理解大豆轉運蛋白在類黃酮色素轉運中的功能打開了一個切入點。蒺藜苜蓿MATE轉運蛋白家族包含70個成員,它們可能都有著重要的生理學功能但是大多數(shù)都還沒有被鑒定出來。本研究通過生物信息學分析結合分子遺傳手段鑒定了蒺藜苜蓿中與檸檬酸分泌和鐵穩(wěn)態(tài)有關的MATE轉運蛋白。MtMATE69是一個缺鐵環(huán)境下誘導的檸檬酸轉運蛋白。MtMATE69過表達發(fā)根系在缺鐵和鐵過量脅迫下鐵穩(wěn)態(tài)和植物激素的水平都發(fā)生了改變。MtMATE66主要在根中表達,它是一個質膜檸檬酸轉運蛋白;而相應的蒺藜苜蓿突變體mtmate66在缺鐵環(huán)境下表現(xiàn)出失綠黃化。MtMATE55與蒺藜苜蓿幼苗發(fā)育、鐵穩(wěn)態(tài)以及植物激素信號都有關聯(lián)。突變體mtmate55表現(xiàn)出發(fā)育延遲以及葉片萎黃。不論敲除MtMATE55還是在突變體中過表達MtMATE55都會引起鐵穩(wěn)態(tài)改變以及植物激素水平異常。本研究初步的研究結果揭示了蒺藜苜蓿MATE轉運蛋白在多種逆境下在金屬營養(yǎng)元素以及激素信號中的基本功能。
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.1;S541
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本文編號：2688700