【摘要】：目的:1.分離和鑒定白及中的次生代謝產(chǎn)物。2.篩選白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物,并建立測(cè)量次生代謝產(chǎn)物含量的方法。3.構(gòu)建白及液體懸浮培養(yǎng)技術(shù)體系,并建立細(xì)胞生長(zhǎng)量及次生代謝產(chǎn)物累積量的動(dòng)態(tài)變化曲線。4.優(yōu)化白及液體懸浮培養(yǎng)體系。方法:1.白及次生代謝產(chǎn)物的分離與鑒定:采用95%乙醇對(duì)白及塊莖干粉進(jìn)行回流提取,以溶液萃取法對(duì)粗提物進(jìn)行萃取得到正丁醇萃取部位。利用多種硅膠柱色譜及半制備型高效液相對(duì)該部分中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化,利用核磁共振等波譜技術(shù)進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)鑒定。2.建立運(yùn)用高效液相色譜配置二極管陣列檢測(cè)器(High performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)檢測(cè)白及次生代謝產(chǎn)物含量的方法:以分離得到的次生代謝產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品,篩選白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物,并利用分析型高效液相色譜定量分析方法測(cè)定次生代謝產(chǎn)物的含量。3.白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特性的研究:以白及種子為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)誘導(dǎo)、繼代得到疏松愈傷組織,以愈傷組織為外植體構(gòu)建白及液體懸浮培養(yǎng)體系,并監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),繪制生長(zhǎng)曲線,同時(shí)實(shí)時(shí)測(cè)量培養(yǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物的積累和變化情況。4.響應(yīng)面法優(yōu)化白及細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)體系:在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法的博克斯-本肯設(shè)計(jì)(Box-Behnken design,BBD)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案,在非激素水平優(yōu)化白及液體懸浮培養(yǎng)體系,使其次生代謝產(chǎn)物累積量達(dá)到最大值。結(jié)果:1.從白及塊莖乙醇提取物的正丁醇萃取部分中分離得到20個(gè)次生代謝產(chǎn)物,其中包括一種新的化合物。其結(jié)構(gòu)分別鑒定為2,2′,2′′,7,7′,7′′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahydro-1,8,1′,6′′-triphenanthrene(1)、gymnosideⅥ(2)、dactylorhin A(3)、militarine(4)、2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲(5)、2,7-二羥基-3,5-二甲氧基-9,10-二氫菲(6)、2,3,7-三羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲(7)、2,6-雙(對(duì)羥苯基)-3',5-二甲氧基-3-羥基聯(lián)芐(8)、3,3'-二羥基-2-對(duì)羥苯基-5-甲氧基聯(lián)芐(9)、2,6-雙(對(duì)羥苯基)-3,3'-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(10)、3,3'-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(11)、3,3'-二羥基-2-(4-羥苯基)-5-甲氧基聯(lián)芐(12)、3-羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(13)、3-羥基-5,3′-二甲氧基聯(lián)芐(14)、1-對(duì)羥苯基-2-羥基-4,7-二甲氧基菲(15)、4,7,4′,7′-四羥基-2,2'-二甲氧基-1,1'-聯(lián)菲(16)、對(duì)羥基苯甲醛(17)、對(duì)羥基苯甲醇(18)、對(duì)羥基芐甲醚(19)、對(duì)羥基芐乙醚(20)。2.以上述從白及塊莖中分離得到的20種次生代謝產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品,從白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中篩選得到4種次生代謝產(chǎn)物:對(duì)羥基苯甲醇(18)、dactylorhin A(3)、militarine(4)、coelonin(5)作為白及液體懸浮培養(yǎng)體系次生代謝產(chǎn)物檢測(cè)的指標(biāo)成分;利用HPLC-DAD檢測(cè)其質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系并建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考察,結(jié)果表明精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、加樣回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合次生代謝產(chǎn)物衡量分析要求。3.選取繼代培養(yǎng)2次約30天的嫩黃疏松型愈傷組織作為起始白及液體懸浮培養(yǎng)的外植體,進(jìn)行白及細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng),并進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及次生代謝產(chǎn)物累積曲線的繪制,通過(guò)對(duì)白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的分析發(fā)現(xiàn)Logistic函數(shù)方程曲線與試驗(yàn)數(shù)據(jù)更為接近。同時(shí)對(duì)白及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物累積量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲醇在接種培養(yǎng)后39d累積量可以達(dá)到最大值,dactylorhin A與militarine的累積量均在接種培養(yǎng)后24d達(dá)到最大,coelonin的累積量在接種培養(yǎng)后18d達(dá)到最大。4.響應(yīng)面法分析發(fā)現(xiàn),參數(shù)組合培養(yǎng)液體積為21.74 mL、初始愈傷組織添加量為0.92g、培養(yǎng)液中蔗糖濃度為28.77 g/L培養(yǎng)得到的白及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中對(duì)羥基苯甲醇的含量可以達(dá)到最大值0.7928 mg/g;參數(shù)組合培養(yǎng)液體積為40.13 mL、初始愈傷組織添加量為0.82g、培養(yǎng)液中蔗糖濃度為30.73 g/L培養(yǎng)得到的白及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中dactylorhin A的含量可以達(dá)到最大值7.7920 mg/g;參數(shù)組合培養(yǎng)液體積為38.35 mL、初始愈傷組織添加量為1.40g、培養(yǎng)液中蔗糖濃度為38.32 g/L培養(yǎng)得到的白及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中militarine的含量可以達(dá)到最大值9.4467 mg/g;參數(shù)組合培養(yǎng)液體積為39.87 mL、初始愈傷組織添加量為1.19g、培養(yǎng)液中蔗糖濃度為31.16 g/L培養(yǎng)得到的白及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中coelonin的含量可以達(dá)到最大值0.3451 mg/g。結(jié)論:本研究以白及種子為實(shí)驗(yàn)材料,成功建立起細(xì)胞液體培養(yǎng)體系,并以從白及中分離得到20種次生代謝產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品,篩選得到白及液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的4種次生代謝產(chǎn)物,研究了白及細(xì)胞生長(zhǎng)量與這4種次生代謝產(chǎn)物累積的關(guān)系,最后通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了白及液體懸浮培養(yǎng)的體系,得到了非激素水平各因素的最佳條件組合,成功獲得了高次生代謝產(chǎn)物累積量的白及液體懸浮培養(yǎng)體系。
【圖文】：

提取物的正丁醇萃取部分中分離得到 20 個(gè)次生代謝產(chǎn)物, 經(jīng)核磁共振等波譜技術(shù) 進(jìn) 行 化 合 物 結(jié) 構(gòu) 鑒 定 ， 其 結(jié) 構(gòu) 鑒 定 為2,2′,2′′,7,7′,7′′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahydro-1,8,1′6′′-triphenanthrene (1)、gymnoside Ⅵ (2)、dactylorhin A (3)、militarine (4)、2,7-二羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲(5)、2,7-二羥基-3,5-二甲氧基-9,10-二氫菲(6)、2,3,7三羥基-4-甲氧基-9,10-二氫菲(7)、2,6-雙(對(duì)羥苯基)-3',5-二甲氧基-3-羥基聯(lián)芐(8)3,3'-二羥基-2-對(duì)羥苯基-5-甲氧基聯(lián)芐(9)、2,6-雙(對(duì)羥苯基)-3,3'-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(10)、3,3'-二羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(11)、3,3'-二羥基-2-(4-羥苯基)-5-甲氧基聯(lián)芐(12)、3-羥基-5-甲氧基聯(lián)芐(13)、3-羥基-5,3′-二甲氧基聯(lián)芐(14)、1-對(duì)羥苯基-2羥基-4,7-二甲氧基菲(15)、4,7,4′,7′-四羥基-2,2'-二甲氧基-1,1'-聯(lián)菲(16)、對(duì)羥基苯甲醛(17)、對(duì)羥基苯甲醇(18)、對(duì)羥基芐甲醚(19)、對(duì)羥基芐乙醚(20)。其中化合物 1 為新化合物，化合物 6、7、13、16、19 首次從白及屬植物中分離得到，化合物 18、20 首次從白及中分離得到。白及中的次生代謝產(chǎn)物見(jiàn)圖 1-1 和表 1-3。

士學(xué)位論文 位移 (C156.2, 157.2, 121.5 和 153.0), 以及 H-5′′、H-6′合，得出構(gòu)成化合物 1 的 C 單元結(jié)構(gòu)為：2′′,7′′-二羥基-6′′基團(tuán)。通過(guò)分析 H-5′′與 C-1、H-3 與 C-1 和 H-10 與 C-1了 C 單元結(jié)構(gòu)與 C-1 相連接。同時(shí)考慮到分子組成，，A C-8 和 C-1'直接連接。NOESY 譜進(jìn)一步證實(shí)了位于 C氧基與 H-5、H-5'和 H-5′′的相關(guān)性。因此化合物 1 的結(jié)′-hexahydroxy-4,4′,4′′-trimethoxy-[9,9′,9′′,10,10′,10′′]-hexahyhrene。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.239

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本文編號(hào)：2686681