【摘要】：馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)因其豐富全面的營養(yǎng)得到廣泛的使用,其加工產(chǎn)業(yè)中的高附加值產(chǎn)品薯條薯片等,因其獨特的風味而備受人們喜愛,然而馬鈴薯中的低溫糖化現(xiàn)象嚴重阻礙了薯條薯片等油炸加工產(chǎn)品的發(fā)展。淀粉是馬鈴薯塊莖的主要儲能形式,前人研究表明,淀粉處于淀粉-糖代謝的源頭,是造成低溫糖化的主要因素之一,其中β-淀粉酶9(StBAM9)盡管檢測不到淀粉酶活性,但對馬鈴薯的低溫糖化有著重要作用,為了研究這類無β-淀粉酶活性的蛋白是發(fā)揮功能的機制,本研究主要從蛋白水平對StBAM9互作蛋白進行了分離,并完成了驗證及互作機制解析,主要研究結果如下:1.利用馬鈴薯低溫糖化酵母文庫對StBAM9的互作蛋白進行了篩選,得到了92個與StBAM9和StBAM9-P互作的蛋白,其中與StBAM9和StBAM9-P都互作的蛋白有12個,通過WEGO分析,兩者的潛在互作蛋白在定位、分子功能以及生物學途徑上相似,主要定位在細胞內(nèi),大多數(shù)是具有催化活性和結合功能的蛋白,且大部分蛋白富集在細胞、代謝、生物調控以及對刺激的響應的生物學途徑上。通過酵母點對點驗證,初步得到4個互作蛋白分別是StDUF842、StTPR01660、StTPR22129和StTPR45174。2.為了明確StDUF842、StTPR01660、StTPR22129和StTPR45174在馬鈴薯栽培種E3中不同組織及塊莖低溫處理下的表達模式,我們通過qRT-PCR進行定量分析,得到StDUF842、StTPR22129在葉片中相對表達量高,StTPR01660在葉片和成熟的薯塊中相對表達量高,StTPR4517334在成熟薯塊中相對表達量高,其中StTPR01660和StTPR45174與StBAM9類似,在成熟的薯塊中表達量高。葉片是馬鈴薯主要的產(chǎn)能器官,薯塊是馬鈴薯主要的儲能器官,推測它們都很有可能參與淀粉的降解。3.為了明確StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174的亞細胞位置,分別構建GFP融合表達載體GFP-StDUF842、GFP-StTPR01660、GFP-StTPR22129、GFP-StTPR45174,通過農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達得到StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174都定位于細胞質。4.為了進一步明確互作蛋白與StBAM9在植物細胞中的互作部位,我們通過BiFC對StDUF842、StTPR01660、StTPR22129、StTPR45174與StBAM9進行互作驗證,發(fā)現(xiàn)只有StTPR01660與StBMA9互作于淀粉粒上,另外StTPR01660與定位在質體基質中的β-淀粉酶1(StBAM1)互作于細胞質。另外,GST pull down結果表明StTPR01660與StBAM9有互作,且還發(fā)現(xiàn)StTPR45174與StBAM9有著較強的互作。而前期研究表明StBAM9定位在淀粉上,由此我們推測StTPR01660可能在細胞質中與StBAM1互作,形成復合體,并通過StBAM9的招募,到達淀粉粒上,從而實行淀粉粒上淀粉降解的功能;此外,是否存在StTPR45174等其他蛋白參與這個過程,還有待于進一步確定。5.為了明確StTPR01660、StBMA1與StBMA9間互作的區(qū)段,我們以不同的StTPR01660短截區(qū)段與StBMA9進行酵母點對點實驗,結果表明StTPR01660完整的TPR domain區(qū)段(第181到277個氨基酸區(qū)段)才能與StBMA9互作。通過NCBI對StBAM1進行結構域的預測,發(fā)現(xiàn)第1到85個氨基端區(qū)段有一個質體轉運肽,第111到542個氨基端區(qū)段為葡糖基水解酶結構域。通過將水解結構域進行短截,我們得到StBAM1的第330到413個氨基酸區(qū)段與StBAM9-P互作。通過NCBI對StBAM9進行結構域的預測,發(fā)現(xiàn)第1到63個氨基端區(qū)段有一個質體轉運肽,第88到506個氨基端區(qū)段為葡糖基水解酶結構域。通過將水解結構域進行短截,我們得到StBAM9的第238到386個氨基酸區(qū)段與StBAM1互作。StBAM1和StBAM9這兩個短截的區(qū)段里含有兩個相同的底物結合位點(賴氨酸和組氨酸),推測StBAM9可能借助StBAM1行使降解淀粉的功能。6.通過StBAM9干涉株系中直鏈和支鏈淀粉含量測定結果表明,在4℃30 d處理條件下,支鏈淀粉的降解速度比直鏈淀粉的降解速度慢,StBAM9更青睞于支鏈淀粉,我們可以進一步通過蛋白體外添加實驗,明確互作蛋白與StBAM9可能的功能機制。此外,StBAM9干涉株系及對照的淀粉磷含量測定結果表明干涉株系與對照E3相比無顯著差異,說明StBAM9調控的淀粉降解可能不是通過淀粉磷酸化的途徑。
【圖文】：

綠體和造粉體是植物合成淀粉的主要場所。光合作用旺盛時，葉綠體可和累積淀粉（瞬時淀粉），暫時貯藏，為植物呼吸、蔗糖合成等提供碳an et al 1999），同時非光合組織也可以通過運輸?shù)街参锏淖尤~、胚乳、莖等器官的貯藏細胞中的葡萄糖或蔗糖，在造粉體中合成淀粉粒，貯藏 1）。淀粉的合成主要包括直鏈淀粉的合成和支鏈淀粉的合成，其中直要是由顆粒性淀粉合酶（GBSS）完成（Visser et al 1991），而支鏈淀分支酶（branching enzyme, BE），可溶性淀粉合酶（starch synthase, S（branching enzymes, DBE）等多個淀粉合成同工酶協(xié)同完成（Jeon。在葡聚糖開始階段，，最初合成直鏈麥芽低聚糖和具有無規(guī)分支的麥芽著合成具有簇狀結構的支鏈麥芽糖糊精，其可以作為正常支鏈淀粉分子的引物，從而不斷引發(fā)支鏈的合成，支鏈淀粉和直鏈淀粉一起形成半結不溶性的淀粉顆粒。

解處于淀粉-糖代謝的源頭，是細胞中可溶性糖類形成的最是一個十分復雜的過程，是多個酶協(xié)同作用的結果（圖 2粉通過兩種途徑降解：一是淀粉的酶促水解，一是淀粉的磷的瞬時淀粉可以通過α-淀粉酶等將葡聚糖水解成麥芽糖和葡can, water dikinase（GWD）和 Phosphoglucan, water dikinas粉葡萄糖殘基中的 C6 和 C3 的磷酸化，使淀粉分子的空間在脫支酶如 ISA3 作用下脫去分支，產(chǎn)生麥芽糖；或者在磷ess（SEX4）作用下使得淀粉葡萄糖殘基中的 C6 和 C3 脫去糖鏈，然后在β-淀粉酶淀粉酶作用下水解成麥芽糖以及極限脫支酶（branching enzymes, DBE）切割α-1, 6 糖苷鍵進一步芽糖由麥芽糖轉運蛋白轉運細胞質經(jīng)葡糖糖苷轉移酶水解萄糖轉運蛋白運輸出葉綠體（Samuel et al 2010; Zhang et a
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S532

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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相關博士學位論文 前2條

1 侯娟;馬鈴薯低溫糖化相關淀粉酶基因的功能鑒定及機制解析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2017年

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本文編號：2677125