【摘要】：人參是名貴中藥,人參皂苷是人參的主要活性物質(zhì)。由于人參基因組大而復(fù)雜,目前有關(guān)其遺傳背景仍所知甚少。人參遺傳信息的缺乏,已經(jīng)嚴(yán)重影響人參產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。人參皂苷的積累和分布發(fā)生在特定組織,但有關(guān)分子機制的研究較少。本研究基于本草基因組學(xué)研究策略,應(yīng)用二代測序技術(shù)首次組裝完成人參全基因組序列;利用質(zhì)譜成像技術(shù)定位人參皂苷空間分布,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)全面解析了人參根部組織層面分子表達模式,旨在通過關(guān)聯(lián)人參皂苷分布和分子差異表達篩選潛在人參皂苷合成關(guān)鍵基因,闡述人參皂苷生物合成途徑及其調(diào)控機制。主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)果如下:1.人參全基因組測序解析人參生物遺傳背景利用二代測序技術(shù)對人參進行全基因組測序,組裝得到3.41Gb的人參基因組圖譜。人參基因組含有62%以上的重復(fù)序列,編碼42,006個基因,包括488個細(xì)胞色素P450基因;2,556個轉(zhuǎn)錄因子和3,745個轉(zhuǎn)運蛋白,這些注釋基因可能是與次生代謝相關(guān)的重要基因。注釋到31個人參皂苷合成保守途徑(甲羥戊酸,MVA)及33個互補途徑(磷酸甲基赤蘚糖醇,DXR/MEP)相關(guān)酶基因,且多個酶基因存在多拷貝現(xiàn)象。我們推測,MVA/MEP途徑中存在的多種異構(gòu)體,有助于三萜化合物生物合成的靈活生產(chǎn)或調(diào)控。此外,共鑒定了 225個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT),這些UGTs也是人參基因組中最大基因家族之一�；蚪M結(jié)構(gòu)信息和進化分析表明,串聯(lián)重復(fù)有助于UGTs的擴增和分化。人參基因組在其進化過程中富集了大量的UGT家族,這種富集與人參皂苷的多樣性有關(guān)。這些結(jié)果促進了人參基因組研究,加深了對三萜化合物生物合成的理解。2.人參代謝組檢測揭示人參皂苷的空間分布基于DESI-MS獲得了人參根部橫切面人參皂苷的空間分布圖像,發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1/Rf顯著富集在根部的周皮和內(nèi)部中柱中;Re,Rb1,Rs1/Rs2,Ra1/Ra2和假人參皂甙Rc1主要分布在外圍周皮中,而根中心分布較少或含量極低;Ra3和Rd在整個橫切面均有分布。隨后,采用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對經(jīng)剝離后的人參根三部分組織中的8種人參皂苷進行定量,發(fā)現(xiàn)Rg1,Re,Rf,Rg2,Rb1,Rc,Rb2和Rd均在周皮中含量最高,且顯著高于皮部和中柱(P0.001)。其中Rg1,Re,Rf和Rb1在周皮中顯著富集與質(zhì)譜成像結(jié)果一致。這些研究再次表明人參根部人參皂苷分布不均一,推測次生代謝物不均勻分布與植物的防御機制及人參皂苷生物合成基因的表達差異有關(guān),為進一步分子水平轉(zhuǎn)錄和翻譯分析提供依據(jù)。3.人參轉(zhuǎn)錄組測序揭示人參根組織層面基因表達模式人參根組織層面轉(zhuǎn)錄組測序,檢測到32,144個表達基因,共表達基因占56.4%,組織特異性表達基因為659～797個,提示人參根組織層面基因轉(zhuǎn)錄的一致性和差異性。發(fā)現(xiàn)超過2.1萬個表達基因與人參皂苷的含量正相關(guān),說明人參皂苷生物合成和調(diào)控的復(fù)雜性。組織間兩兩比較基因表達模式,篩選得到2,116個差異表達基因,主要參與代謝過程、細(xì)胞過程、單有機體過程、定位、響應(yīng)刺激、生物學(xué)調(diào)控;作用于細(xì)胞、細(xì)胞膜及細(xì)胞器;主要行使催化活性、結(jié)合及轉(zhuǎn)運蛋白活性。人參皂苷生物合成途徑中,三個組織中均有高表達的基因,如HMGR,PMK,IDI,SS,DDS和CAS在周皮中高表達,HMGS,MVD,FPS,SS,SE,OAS和PPT 在皮部中高表達,HMGR和SE在中柱中高表達,表明同一組織中不同基因在人參皂苷合成過程中的表達與調(diào)控的協(xié)同性和一致性,同時反映了同一基因家族的不同拷貝在時間和空間上的差異表達模式。三個拷貝的HMGR、兩個拷貝的FPS、兩個拷貝的DDS及60個UGTs在周皮中高表達,可能與多個人參皂苷在周皮中積累量較高有關(guān)。另外,19個人參皂苷合成相關(guān)基因發(fā)生差異可變剪接,表明可變剪接事件在人參皂苷生物合成途徑中起重要的調(diào)控作用。本研究所獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有效地增強了對人參皂苷生物合成途徑的解析。4.人參蛋白質(zhì)組檢測揭示人參根組織層面蛋白表達模式采用Lable-free技術(shù)探索人參根部組織層面蛋白表達模式,檢出2,719個蛋白。共表達蛋白占83.3%,組織特異性表達蛋白為172～500個,周皮中特異性表達蛋白最多,提示人參根組織層面蛋白表達的一致性和差異性。組織間兩兩比較蛋白表達模式,篩選得到839個差異表達蛋白,主要與結(jié)合、催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運蛋白活性、抗氧化活性等有關(guān),參與植物體內(nèi)包括核糖體、氨基酸生物合成、碳代謝、淀粉和糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、糖酵解或糖質(zhì)新生等代謝途徑。相比皮部和中柱,90%的抗性相關(guān)蛋白在周皮中高表達,其中22個蛋白較皮部和中柱顯著上調(diào)表達,反映了周皮作為保護組織行使防御作用的分子機制。此外,共鑒定到28個與人參皂苷合成相關(guān)蛋白,包括MVA途徑中9個酶,MEP途徑中7個酶及12個UGTs,這些酶在三個組織中的差異表達可能與其人參皂苷的合成及分布不均有關(guān)。本研究從整體蛋白質(zhì)水平上探索人參根部代謝物不均勻分布的分子機制,篩選出與人參皂苷合成相關(guān)的差異蛋白,并對轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果進行驗證和補充。5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析通過聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)RNA-seq和Lable-free數(shù)據(jù)間呈弱相關(guān)性。三個比較組中,差異表達趨勢一致的分別有62個,98個和18個,這些基因多數(shù)在周皮中上調(diào)表達,主要與生物過程中的代謝過程、單-有機體過程、細(xì)胞過程、響應(yīng)刺激等及分子功能中的催化活性、結(jié)合等有關(guān),且其中參與代謝途徑的基因數(shù)最多,提示這些分子對人參根的生長發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。超過88%的分子在mRNA水平差異表達,但在本試驗中未檢出蛋白表達,包括31個與人參皂苷合成相關(guān)的基因。在蛋白水平表達差異而mRNA水平無差異的分子中,99%以上檢測出轉(zhuǎn)錄表達,包括7個與人參皂苷合成相關(guān)的酶,提示一些分子可能受到翻譯后調(diào)控或運輸?shù)挠绊�。本文繪制了人參基因組圖譜,并對人參根組織層面的分子表達模式進行了全面研究,為進一步人參研究提供了強大的基因資源,將有助于改善對人參皂苷生物合成、積累和運輸?shù)膹?fù)雜機制的理解。
【圖文】：

Table1.2 Statistical analysis of the P. ginseng draft genome. Size(bp) NumberContigN90 4,516 150,620N80 8,639 103,388N70 12,833 75,040N50 21,977 39,481Longest 574,183 -Total size 2,999,700,459 337,439ScaffoldN90 24,143 33,423N80 45,718 23,391N70 65,171 17,168N50 108,708 9,072Longest 1,303,414 -Total size 3,414,349,854 83,074Gap ratio 12.15%*-

基因組蛋白預(yù)測 ab initio 和同源比對，應(yīng)用 MAKER Pipline 從人參基因 42,006 個蛋白質(zhì)編碼基因模型，其中 88%的基因可從 R到。利用不同的數(shù)據(jù)庫對人參基因功能進行注釋，超過 9ank 非冗余數(shù)據(jù)庫中注釋得到（E- value = 1e-5），，Gene O注釋的基因占 73.47％，利用 Kyoto Encyclopedia of G（KEGG）注釋共有 68.39％的基因參與細(xì)胞生化過程（釋基因中，包括可能與次生代謝相關(guān)的重要基因：如 4880 基因（包括 PPD-人參皂甙合酶（PPDS）CYP716A47，酶（PPTS）CYP716A53，以及齊墩果酸合酶 CYP716A52子和 3,745 個轉(zhuǎn)運蛋白（圖 1.3 和 1.4）。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.51;Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2659803