【摘要】：花生富含油脂和貯藏蛋白為我國(guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。花生油脂和貯藏蛋白合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,涉及多種代謝途徑、多個(gè)關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。本研究通過(guò)對(duì)4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和小RNA測(cè)序,旨在挖掘油脂和貯藏蛋白合成相關(guān)的基因,以及參與油脂和貯藏蛋白合成調(diào)控的miRNAs,為花生高油脂和高蛋白優(yōu)良品種的育種提供理論依據(jù)。本研究所用材料花生的品種為桂花37,以花后20天(HS_20)、35天(HS_35)、50天(HS_50)和60天(HS_60)的籽粒為材料,分別構(gòu)建了4個(gè)mRNA文庫(kù)和4個(gè)miRNA文庫(kù),進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和小RNA測(cè)序。然后對(duì)轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)的基因和小RNA測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)的基因和miRNA進(jìn)行分類(lèi)注釋、靶因預(yù)測(cè)、GO功能注釋以及KEGG pathway注釋,主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)酸水解法測(cè)定四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花生籽粒油脂含量,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60的油脂含量分別是3.31%、25.89%、45.93%和48.49%。(2)通過(guò)構(gòu)建mRNA文庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60獲得的Total Clean Reads分別是109321068、106867224、109313082和107123540,Q20分別是97.95%、97.88%、97.87%和98.03%。(3)在HS_20-vs-HS_35比較組中,差異表達(dá)基因總數(shù)是25769個(gè),其中上調(diào)差異表達(dá)的基因有3235個(gè),下調(diào)差異表達(dá)的基因有22534個(gè);在HS_35-vs-HS_50比較組中,差異表達(dá)基因總數(shù)是18403個(gè),其中上調(diào)差異表達(dá)的基因有11579個(gè),下調(diào)差異表達(dá)的基因有6824個(gè);在HS_50-vs-HS_60比較組中,差異表達(dá)基因總數(shù)是12308個(gè),其中上調(diào)差異表達(dá)的基因有3235個(gè),下調(diào)差異表達(dá)的基因有9073個(gè)。(4)通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),我們篩選到一些與油脂合成相關(guān)的持續(xù)上調(diào)表達(dá)的基因,包括1個(gè)甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移基因、1個(gè)乙酰輔酶A羧化酶基因、2個(gè)硬脂酰-ACP去飽和酶基因、1個(gè)脂肪酸去飽和酶基因、2個(gè)油體相關(guān)蛋白基因和7個(gè)油脂蛋白基因。(5)從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選到參與油脂合成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子和基因有:AP2-EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子、ABI3VP1家族轉(zhuǎn)錄因子、C2C2-Dof轉(zhuǎn)錄因子和WD40repeat基因。(6)從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選到2個(gè)貯藏蛋白基因,基因id號(hào)為107476928和107487873,基因全長(zhǎng)分別是1973和2190bp,開(kāi)放閱讀框分別是1803和1887bp,分別編碼600和628個(gè)氨基酸�；ê�20天、35天、50天和60天的籽粒中,107476928基因的表達(dá)量分別為24.66、753.54、1439.3和1609.72;107487873基因的表達(dá)量分別為0.69、73.69、318.99和247.67。另外,還篩選到1個(gè)屬于致敏原的貯藏蛋白基因Ara h1,基因id號(hào)為107466960,基因全長(zhǎng)是1949bp,開(kāi)放閱讀框是1764bp,編碼587個(gè)氨基酸。花后20天、35天、50天和60天的籽粒中的表達(dá)量分別為23.89、19053.57、14250.28和19428.49。(7)通過(guò)構(gòu)建miRNA文庫(kù)和小RNA測(cè)序,HS_20、HS_35、HS_50和HS_60文庫(kù)獲得的Clean tag分別是27054913、26278062、26831657和25659103,Q20分別為99.3%、99.3%、99.2%和99.2%。各樣品比對(duì)上基因組的small RNA的數(shù)目分別為19724495、19783102、19398380和18860495。(8)對(duì)miRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行分析,HS_20-vs-HS_35的差異表達(dá)miRNA有151個(gè),其中上調(diào)miRNA有100個(gè),下調(diào)miRNA有51個(gè);HS_35-vs-HS_50的差異表達(dá)miRNA有153個(gè),其中上調(diào)miRNA有40個(gè),下調(diào)miRNA有113個(gè);HS_50-vs-HS_60的差異表達(dá)miRNA有146個(gè),其中上調(diào)miRNA有88個(gè),下調(diào)miRNA有58個(gè)。(9)篩選到一些可能參與花生油脂和貯藏蛋白合成調(diào)控的差異表達(dá)miRNAs。分別屬于miR156b家族(ahy-miR156b-3p和ahy-miR156b-5p),miR156c家族(ahy-miR156c)和miR159家族成員(ahy-miR159)。篩選到1個(gè)貯藏蛋白基因調(diào)控miRNA(基因ahy-miR156a),其靶基因是XM_016083519.2。(10)通過(guò)基因的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)和功能注釋分析,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的差異表達(dá)基因和小RNA測(cè)序中的差異表達(dá)miRNAs,主要參與的生物過(guò)程是代謝過(guò)程,主要的分子功能是催化活性功能。(11)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的4個(gè)差異表達(dá)基因和小RNA測(cè)序中的4個(gè)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行了RT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明,驗(yàn)證結(jié)果中基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序的結(jié)果基本一致。
【圖文】：

底燒瓶的質(zhì)量（g）；m2：樣品的質(zhì)量（g）；100：換算系數(shù) RNA 的提取 RNA 是采用 Takara 的試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。 RNA 質(zhì)量的檢測(cè)糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。升總 RNA，，進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。分光光度計(jì)檢測(cè)其純度。 文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序及數(shù)據(jù)處理建以及測(cè)序工作由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成，考文獻(xiàn)[91]，文庫(kù)構(gòu)建流程如下圖所示。

圖 2 數(shù)據(jù)分析流程圖Fig.2 The flow chart of data analysis屬轉(zhuǎn)錄因子的分類(lèi)注釋是一群能與 5’端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。通過(guò) getorf 檢測(cè) Unigene使用 hmmsearch 將 ORF 比對(duì)到轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域，根lantTDB）描述的轉(zhuǎn)錄因子家族特征對(duì) Unigene 進(jìn)行能力鑒表達(dá)量統(tǒng)計(jì)及差異表達(dá)基因的篩選KM（Fragments Per kb per Million fragments）來(lái)計(jì)算基因的的 reads 中匹配到外顯子的每 1K 個(gè)堿基上的 reads 個(gè)數(shù)。因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)（Fold change）。差異表 ≤0.001 且倍數(shù)差異在 2 倍以上。
【學(xué)位授予單位】：廣西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S565.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2656089