【摘要】：水稻開(kāi)花期是指從播種到始穗所經(jīng)歷的天數(shù),是影響水稻地區(qū)適應(yīng)性、季節(jié)適應(yīng)性和產(chǎn)量的重要因素之一。本研究在特青(TQ)導(dǎo)入珍汕97(ZS)的導(dǎo)入系BC_4F_2代中定位了一個(gè)調(diào)控開(kāi)花期、株高和產(chǎn)量的多效性QTL,Ghd6,它在長(zhǎng)、短日照條件下都促進(jìn)抽穗,對(duì)光周期不敏感。我們通過(guò)圖位克隆策略分離了Ghd6,并對(duì)Ghd6的分子功能進(jìn)行了探索。本研究的主要結(jié)果如下:1.Hd1是Ghd6的候選基因:在BC_4F_2群體中,開(kāi)花期、株高和每穗穎花數(shù)共分離,呈現(xiàn)3:1的單基因分離比。含有TQ等位型的Ghd6植株NIL-TQ相比ZS等位型的植株NIL-ZS抽穗延遲、株高和每穗穎花數(shù)增加。借助3300株Ghd6的BC_4F_2群體,選擇極端晚抽穗、株高較高的576個(gè)單株篩選重組單株。把Ghd6定位在標(biāo)記Ghd6-12和S56標(biāo)記區(qū)間,該區(qū)間包含開(kāi)花期調(diào)控關(guān)鍵基因Hd1。比較測(cè)序發(fā)現(xiàn),TQ等位型Hd1在CCT保守結(jié)構(gòu)域缺失了4 bp,造成了移碼突變。所以Hd1是Ghd6的候選基因。2.Hd1/Ghd6轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證:構(gòu)建ProHd1:Hd1:GFP載體轉(zhuǎn)化NIL-TQ,T_1共分離檢測(cè)和T_2代表型考察表明,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株比陰性植株開(kāi)花期顯著提前、株高和每穗穎花數(shù)顯著降低,并且恢復(fù)到ZS的水平。同時(shí)敲除ZS的Hd1,T_1代突變植株表現(xiàn)出了晚抽穗表型,并且與NIL-TQ開(kāi)花期一致。因此,Hd1就是多效性QTL Ghd6。3.Hd1在長(zhǎng)日照條件下功能轉(zhuǎn)換:對(duì)NIL-ZS和NIL-TQ進(jìn)行了長(zhǎng)、短日照處理,發(fā)現(xiàn)NIL-ZS在長(zhǎng)、短日照條件下均抽穗提前、株高降低、每穗穎花數(shù)減少和產(chǎn)量降低。表明在ZS背景下,Hd1在長(zhǎng)、短日照條件下均促進(jìn)抽穗,對(duì)光周期不敏感。Real-time PCR分析表明,Hd1在長(zhǎng)、短日照下通過(guò)上調(diào)Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)抽穗。之前的研究認(rèn)為Hd1在長(zhǎng)日照條件下抑制抽穗,而在短日照下促進(jìn)抽穗,表現(xiàn)出強(qiáng)烈的光周期敏感性。因此,Hd1在長(zhǎng)日條件下表現(xiàn)出雙向調(diào)控開(kāi)花的功能,我們稱(chēng)之為Hd1功能轉(zhuǎn)換。4.Hd1的功能轉(zhuǎn)換依賴(lài)于Ghd7:發(fā)現(xiàn)Hd1在ZS背景下長(zhǎng)、短日照均促進(jìn)抽穗。而在明恢63(MH)背景下Hd1在長(zhǎng)日照條件下抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá),延遲抽穗;而在短日照條件下上調(diào)Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá),促進(jìn)抽穗。分析ZS和MH背景下的Ghd7和Hd1兩基因近等基因系不同組合的開(kāi)花期,表明Ghd7決定Hd1在長(zhǎng)日照條件下的功能轉(zhuǎn)換。5.Ghd7.1和Ghd8調(diào)控Hd1功能轉(zhuǎn)換:比較Ghd7、Ghd8和Hd1三基因近等基因系開(kāi)花期,發(fā)現(xiàn)Ghd8可以強(qiáng)烈地增強(qiáng)Ghd7對(duì)Hd1的功能轉(zhuǎn)換。比較Ghd7、Ghd7.1和Hd1三基因在MH和ZS背景下不同組合的開(kāi)花期,發(fā)現(xiàn)在MH背景下Ghd7和Ghd7.1互作促使了Hd1的功能轉(zhuǎn)換,而在ZS背景下Ghd7.1加強(qiáng)了Ghd7促使Hd1功能轉(zhuǎn)換的能力。分析在ZS背景下Ghd7.1和Ghd8有功能而Hd1分離的近等基因系,發(fā)現(xiàn)Ghd7.1Ghd8也可以促使Hd1功能轉(zhuǎn)換。6.Ghd7、Ghd8、Ghd7.1和Hd1不同組合光周期敏感性具有差異:對(duì)Ghd7、Ghd8、Ghd7.1和Hd1不同組合近等基因系進(jìn)行長(zhǎng)、短日照處理,Ghd7Ghd8Hd1對(duì)光周期最為敏感,Ghd7Ghd7.1Hd1、Ghd7Hd1、Ghd8Hd1、Ghd7.1Hd1和Ghd7Ghd7.1具有較強(qiáng)的光周期敏感性,單獨(dú)的Ghd7.1在ZS背景中對(duì)光周期較為敏感而在MH背景中敏感性較弱,單獨(dú)的Ghd7、Ghd8和Hd1以及四基因均無(wú)功能的光周期敏感性微弱甚至不敏感。7.Ghd7、Ghd8和Hd1之間的蛋白互作:Ghd7的CCT結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合Hd1的鋅指結(jié)構(gòu)域(32-111aa)以及鋅指與CCT之間的區(qū)域(112-337aa)。通過(guò)Ghd8的酵母篩庫(kù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ghd8可以和OsHAP5A、OsHAP5B、OsHAP5D、OsHAP5E和OsHAP5O互作,酵母點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證了這一結(jié)果,并且發(fā)現(xiàn)Ghd8還和OsHAP5T互作。同時(shí)也進(jìn)行了Ghd7、Hd1和OsHAP5家族蛋白的酵母互作驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)Hd1和OsHAP5A、OsHAP5B、OsHAP5D以及OsHAP5E互作,Ghd7和OsHAP5A、OsHAP5D及OsHAP5E微弱互作。8.Hd1具有轉(zhuǎn)錄激活活性:Hd1在原生質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)表明Hd1具有轉(zhuǎn)錄激活活性,而且這種轉(zhuǎn)錄激活活性來(lái)自于鋅指與CCT之間的區(qū)域(112-337aa),但是CCT結(jié)構(gòu)域的突變會(huì)嚴(yán)重破壞這種激活活性。通過(guò)向Hd1轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)體系引入Ghd7蛋白,發(fā)現(xiàn)Ghd7可以抑制Hd1的轉(zhuǎn)錄激活活性,但并不能轉(zhuǎn)換該活性為轉(zhuǎn)錄抑制活性。9.Ghd7和Hd1顯著增加Ghd8在全基因組的結(jié)合能力:獲得ZS背景下ProGhd8:Ghd8:GFP和Ghd7、Hd1不同組合的轉(zhuǎn)基因材料,其開(kāi)花期表型基本和近等基因系一致。對(duì)Ghd7-Ghd8:GFP-Hd1材料進(jìn)行免疫沉淀質(zhì)譜聯(lián)用(IP-MS),發(fā)現(xiàn)Ghd8可以和OsHAP5C互作。隨后對(duì)一系列的ProGhd8:Ghd8:GFP轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)(ChIP-seq)分析,解析了Ghd8的全基因結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)Ghd7和Hd1顯著增加了Ghd8結(jié)合DNA的范圍,可能Ghd7和Hd1與Ghd8的蛋白互作加強(qiáng)了其相應(yīng)復(fù)合體結(jié)合DNA的能力。
【圖文】：

圖 1 Ghd6 的 BC4F2分離群體長(zhǎng)日照條件下的開(kāi)花期、株高和每穗穎花數(shù)的次數(shù)分布和表型。A、B 和 C，NIL-ZS（左）和 NIL-TQ（右）在不同時(shí)期的植株和穗子；D、E 和 F，Ghd6 的開(kāi)花期、株高和每穗穎花數(shù)的頻數(shù)分布；G、H 和 I，Ghd6 的開(kāi)花期、株高和每穗穎花數(shù)的表型； Ghd6-ZS 、 H 和 GhdTQ ， Ghd6 位點(diǎn)為純合 ZS 等位型的植株、雜合等位型的植株和純合 TQ 等位型的植株； ** ，t 測(cè)驗(yàn) p 值小于 0.01。

Ghd6-TQ 的 Hd1 編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，TQ 和 Ghd6-TQ 等位型相對(duì)于 ZS 和 Ghd6-ZS 等位型的 Hd1 在保守的 CCT 結(jié)構(gòu)域區(qū)段+1089 位點(diǎn)缺失了 4bp（AAAG）（圖 2B），，造成了移碼突變（圖 2C）。因此我們認(rèn)為 Hd1 是 Ghd6 的候選基因, TQ 等位型 CCT結(jié)構(gòu)域的 4bp 缺失可能造成了 Hd1 功能缺失。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S511

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本文編號(hào)：2647805