【摘要】：茄尼醇是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物,在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。它是含有45個碳原子的反式長鏈聚異戊二烯,根據(jù)萜類的分類屬于多萜的范疇。另外,由于其具有重要的藥用價值及經(jīng)濟價值,對其研究較為廣泛。本研究通過克隆煙草茄尼醇合成過程中的關(guān)鍵酶茄尼基焦磷酸合酶基因SPS,構(gòu)建了pBI121-SPS和pBI121-DXS-SPS過表達(dá)載體,通過煙草遺傳轉(zhuǎn)化進行基因過表達(dá)植株茄尼醇含量分析,探討茄尼醇的生物合成的調(diào)控機制。研究結(jié)果如下:(1)克隆煙草K326的SPS基因序列,大小為1206bp,同源性系統(tǒng)進化分析表明煙草K326 SPS屬于SPS3基因家族,共編碼401個氨基酸,不含信號肽,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,含有15個磷酸化位點,亞細(xì)胞定位在葉綠體,含有兩個結(jié)合Mg~(2+)的保守結(jié)構(gòu)域,是Isoprenoid_Biosyn_C1 superfamily的成員之一。SPS蛋白與絨毛煙草、林煙草和普通煙草高度一致,同源性達(dá)100%,與茄科其他物種辣椒、土豆、番茄等的SPS蛋白的一致性達(dá)到了95%以上,具有異戊烯基焦磷酸合酶典型的DDxxD的結(jié)構(gòu)域,該蛋白具備異戊烯焦磷酸合酶的功能。(2)成功構(gòu)建了pBI121-SPS表達(dá)載體和pBI121-DXS-SPS雙基因共表達(dá)載體,獲得了過表達(dá)SPS基因的轉(zhuǎn)基因植株和過表達(dá)DXS和SPS雙基因的轉(zhuǎn)基因植株。通過熒光定量PCR和高效液相色譜對DXS基因和SPS基因與茄尼醇的含量進行分析,苗期過表達(dá)SPS基因的植株中,SPS基因表達(dá)量最高提升了3.25倍,DXS基因表達(dá)量最高提升了9.3倍,茄尼醇的含量最高提升了3倍左右;過表達(dá)DXS和SPS基因的植株,苗期DXS基因表達(dá)量和SPS基因表達(dá)量最高分別是對照的10.2倍和5.3倍,茄尼醇的含量是對照的2-2.5倍。為提高煙草生物合成茄尼醇提供了有效的方法,對煙草天然活性成分的綜合開發(fā)利用研究,具有重要的理論意義及較高的經(jīng)濟價值。(3)利用發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1、ATCC15834和A4進行了煙草K326的發(fā)根培養(yǎng)高效菌株篩選研究,其中C58C1菌株SPS基因轉(zhuǎn)化效率最高;成功獲得了SPS基因的C58C1轉(zhuǎn)化菌株,轉(zhuǎn)化SPS基因的C58C1菌株浸染煙草外植體的生根率達(dá)到53.2%,在含0.01mg/L NAA+50mg/L SM+50mg/L Rif+50mg/L Kana的MS固體培養(yǎng)基毛狀根生長良好,為建立煙草發(fā)根培養(yǎng)體系生物合成茄尼醇奠定了良好的實驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

甘油醛-3-磷酸為原料，在關(guān)鍵酶 1-脫氧木糖-5-磷酸合酶和 1-脫氧木糖原酶的作用下生成 IPP。第二個步驟是直接前體的生成階段，包括r{牛酸（GPP）、法尼基二磷酸（FPP）、r{牛兒基r{牛兒基二磷酸（GGPP），在這個階段，有三個關(guān)鍵酶，分別是r{牛兒基二磷酸合酶（GPPS）、磷酸合酶（FPS）和r{牛兒基r{牛兒基二磷酸合酶（GGPPS）（圖 1-2 。第三個步驟則是對前體物質(zhì)的修飾，包括環(huán)化、氧化還原、酰化、糖基化等。目前，前兩個步驟已經(jīng)研究的比較清楚，并且，所有的萜類化合都需要經(jīng)過這些步驟。而第三個步驟則是在植物的次生代謝中決定了萜結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。目前，在已知的報道中，植物中合成萜類化合物氧木酮糖-5-磷酸途徑(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatepathway，DXP)或醇 4-磷酸途徑(methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP)和甲羥戊酸valonic acid pathway，MVA)兩種途徑組成。大部分的高等植物基本上P 途徑，并且和 MVA 途徑具有協(xié)同效應(yīng)[30]。有研究表明，MVA 途徑主質(zhì)中，但是，DXP 途徑則主要是在葉綠體[31]。兩條途徑所產(chǎn)生的 IPP分會共用，，但是絕大多數(shù)都是在各自的途徑中繼續(xù)反應(yīng)。

圖 1-2 萜類合成的第二階段和第三階段Figure1-2：The second stage and the third phase of terpenes synthesis1.1.1.2 萜類化合物的其他反應(yīng)1）氧化反應(yīng)不同的氧化劑在不同的條件下，可以將萜類成分中各種基團氧化，生成各種不同的氧化產(chǎn)物。常用的氧化劑有臭氧、鉻酐（三氧化鉻）、四醋酸鉛、高錳酸鉀和二氧化硒等，其中以臭氧的應(yīng)用最為廣泛。四醋酸鉛也是氧化雙鍵的試劑，曾廣泛應(yīng)用在萜類成分的化學(xué)研究工作中[32]。2）脫氫反應(yīng)脫氫反應(yīng)可認(rèn)為是氧化反應(yīng)的一種，為研究萜類特別是環(huán)萜類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)中一種很有價值的反應(yīng)。環(huán)萜的碳架經(jīng)過脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷銦N類衍生物。脫氫反應(yīng)通常在惰性氣體的保護下，用鉑黑或者鈀做催化劑，將萜類成分與硫或硒在惰性氣流中加熱(200℃～300℃)，環(huán)萜的碳架則因脫氫轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷銦N類衍生物，有時復(fù)雜的環(huán)可能裂解，有時也可能有環(huán)合反應(yīng)同時存在[32]。3）加成反應(yīng)萜類成分中的雙鍵多能與氫鹵酸類如氫碘酸或氯化氫在冰乙酸溶液中反應(yīng)，
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S572

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王非,鄭珩,余永柱,楊欣;高純度茄尼醇的現(xiàn)狀與市場前景[J];化工進展;2005年06期

2 管烽偉;顧美娟;;精品茄尼醇的提取研究[J];現(xiàn)代鹽化工;2018年06期

3 葛巖濤;;利用馬鈴薯葉提取制備茄尼醇工藝研究[J];青�？萍�;2008年04期

4 李雪珍;先思蓉;周迎春;;廢次煙葉中有效成分茄尼醇的提取研究[J];遼寧化工;2019年01期

5 黃海濤;劉欣;李晶;許永;王晉;楊葉昆;楊光宇;孔維松;;煙草中茄尼醇的超高效液相色譜法快速測定研究[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2018年12期

6 周凌云;;高純度茄尼醇的精制工藝研究[J];中國民族民間醫(yī)藥;2009年15期

7 高麗娟;張玉松;白文鵬;張立華;林炳昌;;精品茄尼醇低成本生產(chǎn)新技術(shù)[J];現(xiàn)代化工;2006年S1期

8 楊玲娟;張繼;陳桐;徐小龍;馬俊義;孫學(xué)剛;王自社;;馬鈴薯葉中茄尼醇的RP-HPLC分析[J];食品工業(yè)科技;2009年05期

9 張振;;茄尼醇提取分離和測定方法[J];貴州化工;2006年02期

10 許金木;吳朝軍;李桂蘭;;蠶沙中茄尼醇的提取及應(yīng)用[J];蠶桑茶葉通訊;2005年04期

相關(guān)會議論文 前6條

1 陳曉;王敏;;茄尼醇提取過程中皂化條件的優(yōu)化[A];湖北省暨武漢市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會第八屆第十七次學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

2 陳桐;張繼;孫學(xué)剛;徐小龍;張生堂;盧迪;;馬鈴薯葉中茄尼醇的RP-HPLC分析[A];2008年《藥物分析雜志》第三屆普析通用杯論文集[C];2008年

3 李全;古昆;程曉紅;;6-(3′-甲基-4′-苯砜-2′-丁烯基)-2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯二醚的合成改進[A];中國化學(xué)會第四屆有機化學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2005年

4 段娜娜;岳彩鵬;侯萌萌;;煙草中茄尼醇代謝研究[A];中國植物學(xué)會七十五周年年會論文摘要匯編（1933-2008）[C];2008年

5 尹國盛;;茄尼醇的光譜學(xué)研究[A];江蘇、山東、河南、江西、黑龍江五省光學(xué)（激光）聯(lián)合學(xué)術(shù)'05年會論文集[C];2005年

6 蔡君蘭;彭斌;王冰;王f;趙閣;余晶晶;郭軍偉;張曉兵;謝復(fù)煒;;采用濾嘴分析法評估吸煙者的口腔煙氣暴露量[A];中國煙草學(xué)會2016年度優(yōu)秀論文匯編——煙草工業(yè)主題[C];2016年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 徐錚奎;高純度茄尼醇國際市場前景可頤[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2017年

2 本報特約撰稿人 徐錚奎;高純度茄尼醇炙手可熱[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

3 張倫;輔酶Q10為何變臉[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

4 記者 劉楠;申渝公司廢煙稈制藥創(chuàng)收千萬[N];中國化工報;2006年

5 ;輔酶Ｑ_(１０)產(chǎn)能爆發(fā)前夜觀象[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

6 施國俊 盧恒;廢次煙葉再利用 提取茄尼醇技術(shù)在惠水成功投用[N];貴州日報;2004年

7 董耀平 楊虹;輔酶Q10后市可期[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

8 起永俊;初升的太陽[N];楚雄日報(漢);2007年

9 徐錚奎;“多面手”輔酶Q10遇技術(shù)型產(chǎn)能瓶頸[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

10 本報特約撰稿 徐錚奎;輔酶Q10中日較量換位[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前6條

1 林富榮;輔酶Q的合成研究[D];浙江大學(xué);2004年

2 劉江（芻鳥）;層析技術(shù)在天然產(chǎn)物高純度精制中的應(yīng)用和相關(guān)理論研究[D];清華大學(xué);2006年

3 唐德松;煙葉中茄尼醇的提取與分離研究[D];浙江大學(xué);2007年

4 杜雪嶺;天然產(chǎn)物分離純化過程中層析技術(shù)的研究——應(yīng)用及相關(guān)過程模型化[D];北京化工大學(xué);2009年

5 陳s

本文編號：2647573