【摘要】：黃酮類化合物是具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的一類植物次生代謝物,它常以糖苷的形式存在于植物體內(nèi),參與著諸多生命活動。尿苷二磷酸依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferase,UGT)介導(dǎo)著黃酮類化合物的糖基化修飾過程,它能夠?qū)⒍喾N糖基(如葡萄糖,半乳糖,鼠李糖,阿拉伯糖等)從UDP-糖基供體轉(zhuǎn)移到類黃酮糖苷配基上,改變黃酮類化合物的穩(wěn)定性、可溶性及生物活性,參與植物的生長發(fā)育,次生代謝物累積及脅迫響應(yīng)等過程。本研究擬克隆苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycose:flavonoid glycosyltransferase,UFGT)FtUFGT1,FtUFGT5,FtUFGT6,FtUFGT7基因,構(gòu)建各FtUFGT的重組表達(dá)和純化體系,并分析FtUFGT的酶學(xué)性質(zhì),以期為其體外催化黃酮類衍生物的合成奠定基礎(chǔ);此外,研究擬通過重組表達(dá)苦蕎UDP-鼠李糖合酶(UDP-rhamnose synthase,RHM)解決糖基轉(zhuǎn)移酶活性測定底物UDP-鼠李糖缺乏的問題;基于pCAMBIA3301-eGFP植物表達(dá)載體,實現(xiàn)苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶在SR-1煙草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)中的過表達(dá),以期為深入研究FtUFGT對苦蕎次生產(chǎn)物積累的調(diào)控及催化底物奠定材料基礎(chǔ)。研究主要獲得如下研究結(jié)果:(1)從本地苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出4個苦蕎類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因FtUFGT1,FtUFGT5,FtUFGT6,FtUFGT7。多序列比對顯示,所選FtUFGT與來自其他物種的UFGT一致性較高,預(yù)測FtUFGT1與為類黃酮O-糖基轉(zhuǎn)移酶,FtUFGT6為UDP-鼠李糖:類黃酮3-O-葡萄糖苷(1→6)鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶,FtUFGT7為類黃酮C-糖基轉(zhuǎn)移酶。通過qRT-PCR分析了4個FtUFGT基因在苦蕎各組織中的表達(dá)水平,結(jié)果表明,四種FtUFGT基因在苦蕎各組織的表達(dá)模式差異明顯,FtUFGT1,FtUFGT7在花中有最高表達(dá)量;FtUFGT5和FtUFGT6在種子中表達(dá)水平最高。4個基因在莖中表達(dá)水平均最低,預(yù)示四種酶在次生代謝途徑中行使著不同的功能。(2)通過RT-PCR克隆目的基因,經(jīng)無縫克隆構(gòu)建了pGEX-6p-1-FtUFGT1,pGEX-6 p-1-FtUFGT5,pGEX-6 p-1-FtUFGT6,pGEX-6 p-1-FtUFGT7表達(dá)載體,實現(xiàn)了4種目的蛋白在大腸桿菌Rosetta(DE3)中的可溶性表達(dá),并通過GST親和層析純化得到高純度目的蛋白。以槲皮素為底物,采用薄層色譜法及高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法分析了重組FtUFGT1的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明FtUFGT1具有黃酮醇3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性,能夠以UDP-葡萄糖(UDPG)和槲皮素為底物合成異槲皮素。FtUFGT1在30℃,pH7.0條件下可發(fā)揮最高活性,實現(xiàn)槲皮素向異槲皮素的高效轉(zhuǎn)化,比活力為9.174U/mg。含有1μmol/L FtUFGT1的反應(yīng)體系中,槲皮素和UDPG的濃度分別在1.526×10~3~2.287×10~3μmol/L和5.084×10~4~16.980×10~4μmol/L范圍內(nèi)時,酶活性與底物濃度呈良好線性關(guān)系。FtUFGT1的三突變體F21Y_F23Y_F127Y喪失了對槲皮素的糖基化活性。(3)構(gòu)建苦蕎UDP-鼠李糖合酶FtRHM的原核表達(dá)載體pMAL-c4x-FtRHM,實現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá),通過Amylose-Sepharose親和柱純化獲得了目標(biāo)蛋白。以UDPG為底物未檢測到FtRHM的UDP-鼠李糖合成活性。(4)構(gòu)建了四種FtUFGT的pCAMBIA3301-eGFP植物表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法侵染SR-1型煙草。通過Basta抗性篩選和PCR檢測共獲得77株過表達(dá)FtUFGT1煙草,36株過表達(dá)FtUFGT6煙草及2株過表達(dá)FtUFGT7煙草。分光光度法測定過表達(dá)FtUFGT1的T0代煙草中總黃酮含量顯示,各株系總黃酮含量差異無明顯規(guī)律。
【圖文】：

圖 1-1 幾種類黃酮化合物骨架結(jié)構(gòu)Fig.1-1 The structure of several flavonoids 黃酮類化合物的代謝物中黃酮類化合物代謝是 個繁復(fù)的過程，該途徑由多基因參與并受到多調(diào)節(jié)。黃酮類化合物的合成始于苯丙素途徑，這 過程中 L-苯丙氨酸生成oA，香豆酰 CoA 依次合成柚皮素，二氫山梨醇，，二氫槲皮素。二氫槲皮花青素合成通路參與花色素類物質(zhì)的形成，也可以在黃酮醇合酶（Flave，F(xiàn)LS）的作用下轉(zhuǎn)化為槲皮素，接著由 UFGT 糖基化修飾依次形成異槲（燕雪芬 2015）。有研究指出，多種轉(zhuǎn)錄因子通過影響類黃酮合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)水性實現(xiàn)對植物中黃酮類化合物譜的調(diào)節(jié)。目前研究較多的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如 M WD40，它們可以形成 MBW 復(fù)合物調(diào)控該途徑（Imène et al. 2011）。但道 WD40 可以獨立作用于與花青素合成相關(guān)的 DNA 靶序列（Don et al. 20

第 章 引言UGT 由相對較大的多基因家族編碼（Gachon et al. 2005）。據(jù)統(tǒng)計，大約50%植物 UGT-1家族的蛋白質(zhì)在N-末含有44個氨基酸的共有序列，即植物次生產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶（Plant secondary product glycosyltransferase motif,PSPG）基序，這 序列最先由 Jane 和 Monica Hughes（1994）在比對木薯的 8 個 cDNA 序列時發(fā)現(xiàn)，后來在其他植物的次生代謝相關(guān) UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶中也證實了這 序列的存在。來自松葉菊中 UGT73A5 的三維模型顯示 UDP-葡萄糖的尿嘧啶部分與這 基序中高度保守的 HCGWNS 殘基直接進(jìn)行相互作用（Hans et al. 2010），推測這 PSPG 基序參與酶與 UDP-糖的結(jié)合(Kim et al. 2013)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S517

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本文編號：2646584