【摘要】：豆科植物的根瘤共生系統(tǒng)是自然界最主要的生物固氮來(lái)源。根瘤菌感知豆科植物產(chǎn)生的黃酮類(lèi)化合物時(shí)分泌結(jié)瘤因子被視為共生信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程起始。而百脈根結(jié)瘤因子受體NFR1和NFR5是感知結(jié)瘤因子的重要節(jié)點(diǎn)。豆科植物根瘤形成過(guò)程,尤其是早期共生關(guān)系建立過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的深入解析對(duì)于揭示根瘤早期發(fā)育中共生和免疫系統(tǒng)的協(xié)同調(diào)控具有重要意義。目前NFR1下游信號(hào)傳遞機(jī)制仍沒(méi)有得到完全的闡明,因此鑒定與LjNFR1互作的蛋白并揭示其共生信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是研究的重點(diǎn)。本研究以百脈根結(jié)瘤因子受體激酶LjNFR1為誘餌,通過(guò)建立百脈根根瘤共生不同時(shí)期的酵母膜雙雜文庫(kù)篩選獲得了一個(gè)與之互作的生長(zhǎng)素相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lj5NG4,并以此為研究對(duì)象,分析Lj5NG4在百脈根中共生固氮的功能以及作用機(jī)制,主要的研究結(jié)果如下:1.利用系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析不同物種5NG4蛋白,發(fā)現(xiàn)Lj5NG4屬于nodulin MtN21/EamA-like transporter蛋白家族,受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)調(diào)控,其同源蛋白被證實(shí)為生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。將百脈根中已知的生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與Lj5NG4共同進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)Lj5NG4與已知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族處于不同的進(jìn)化分支。2.借助tYFP熒光蛋白信號(hào)的顯微鏡觀察證實(shí)了Lj5NG4在侵染前期根毛中強(qiáng)烈表達(dá),而在后期根瘤內(nèi)部不表達(dá),預(yù)示Lj5NG4更多的在共生侵染前期發(fā)揮功能。3.為進(jìn)一步證實(shí)百脈根中Lj5NG4蛋白與LjNFR1蛋白相互作用的存在,利用酵母雙雜交以及煙草體內(nèi)異源系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證,均表明存在互作。4.利用CRISPR/Cas9對(duì)Lj5NG4進(jìn)行基因敲除,通過(guò)百脈根穩(wěn)定轉(zhuǎn)化,經(jīng)過(guò)兩代篩選得到T2代純合穩(wěn)定突變株。其共生表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明Lj5NG4在共生固氮前期抑制侵染線的形成,對(duì)前期侵染進(jìn)行負(fù)調(diào)控,但對(duì)后期結(jié)瘤沒(méi)有顯著影響�；パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)果。5.鑒于Lj5NG4可能是生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)子,通過(guò)外源施加不同濃度生長(zhǎng)素進(jìn)一步確認(rèn)生長(zhǎng)素能否對(duì)突變體表型產(chǎn)生影響。發(fā)現(xiàn)低濃度(10-7、10-8、10-9 M)的生長(zhǎng)素會(huì)減弱Lj5NG4突變后侵染線增加的表型,對(duì)共生侵染和根瘤發(fā)育發(fā)揮正調(diào)控功能。大豆皂苷對(duì)于調(diào)控大豆性狀品質(zhì)有重要意義,在皂苷合成途徑中B-香樹(shù)脂醇合成酶(AMS)是關(guān)鍵的限速酶,研究意義非常重要。金華南老師課題組將大豆AMS的啟動(dòng)子作為誘餌進(jìn)行酵母單雜篩選,得到大豆Glyma04G、Glyma06G,屬于bHLH蛋白家族。由于大豆基因組存在基因倍增,給研究帶來(lái)很多不便,將其同源基因Lj1g3v2098310.1放在模式植物百脈根中進(jìn)行研究,并將其命名為L(zhǎng)jbHLH93,以此為研究對(duì)象,初步探究該基因?qū)采Y(jié)瘤帶來(lái)的影響,主要的研究結(jié)果如下:1.借助tYFP熒光蛋白信號(hào)的顯微鏡觀察證實(shí)LjbHLH93在幼嫩的根瘤中不表達(dá),而在后期根瘤內(nèi)部的侵染細(xì)胞中有強(qiáng)烈的表達(dá),這預(yù)示著LjbHLH93可能更多的通過(guò)調(diào)控成熟根瘤侵染細(xì)胞從而影響結(jié)瘤。2.通過(guò)凝膠阻滯遷移實(shí)驗(yàn)未能驗(yàn)證百脈根中LjbHLH93蛋白與LjAMS互作,酵母體內(nèi)單雜交進(jìn)行互作驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)LjAMS在酵母中存在自激活,亦無(wú)法驗(yàn)證LjbHLH93與LjAMS相互作用。3.通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)LjbHLH93進(jìn)行敲除,未能獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的突變株,但毛根轉(zhuǎn)化得到的突變株根瘤數(shù)目有顯著減少。而通過(guò)超表達(dá)技術(shù)未能觀察到突變株的共生表型有顯著變化。
【圖文】：

ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官發(fā)生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物對(duì)結(jié)瘤因子的感知可逡逑以引發(fā)植物中一系列的分子和生理反應(yīng)，例如早期共生基因的累積、根毛卷曲和侵逡逑染線（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（圖１－２）。細(xì)菌可以分裂并向皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。盡管剛開(kāi)始根瘤菌的感知發(fā)生在表皮，但后期持續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于根瘤逡逑菌的侵染和釋放的過(guò)程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通過(guò)宿主衍生的管狀隔室發(fā)生，具有根毛的表皮細(xì)胞彎曲包裹著根逡逑瘤菌向內(nèi)生長(zhǎng)，從而形成侵染線。這種生理變化伴隨著根毛極性生長(zhǎng)的重新定向，逡逑產(chǎn)生捕獲細(xì)菌微菌落以形成“侵染區(qū)室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）這種牧羊人鉤結(jié)構(gòu)逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。從這一點(diǎn)來(lái)看，根毛細(xì)胞膜內(nèi)陷并開(kāi)始向表皮細(xì)胞內(nèi)部伸長(zhǎng)，逡逑帶動(dòng)根瘤菌在侵染線內(nèi)部增殖并往下移動(dòng)，與此同時(shí)，，皮層細(xì)胞被重新激活進(jìn)行有逡逑絲分裂以形成根瘤原基，從而起始根瘤器官發(fā)生過(guò)程。侵染線向根內(nèi)部生長(zhǎng)到達(dá)根逡逑瘤原基

＾邐身邋Ｒｈｉｚｏｂｌｕｍ逡逑圖１－１豆科植物與根痛菌相互作用（Ｃｌｕａｅｔａｌ２０１８）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｌｅｇｕｍｅｓ邋ａｎｄ邋ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ逡逑豆科植物形成有效根瘤依賴(lài)著兩個(gè)相互協(xié)同的過(guò)程：根瘤菌侵染（ｒｈｉｚｏｂｉａ逡逑ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋）和根瘤器官發(fā)生（ｎｏｄｕｌｅｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）。宿主植物對(duì)結(jié)瘤因子的感知可逡逑以引發(fā)植物中一系列的分子和生理反應(yīng)，例如早期共生基因的累積、根毛卷曲和侵逡逑染線（ＩＴ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｒｅａｄ）的形成（圖１－２）。細(xì)菌可以分裂并向皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)展（Ｇａｇｅ逡逑ｅｔａｌ２００４）。盡管剛開(kāi)始根瘤菌的感知發(fā)生在表皮，但后期持續(xù)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于根瘤逡逑菌的侵染和釋放的過(guò)程都非常重要（Ｃａｐｏｅｎ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００５，邋Ｄｅｎ邋Ｈｅｒｄｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ邋２００７）。逡逑根瘤菌侵染通過(guò)宿主衍生的管狀隔室發(fā)生，具有根毛的表皮細(xì)胞彎曲包裹著根逡逑瘤菌向內(nèi)生長(zhǎng)，從而形成侵染線。這種生理變化伴隨著根毛極性生長(zhǎng)的重新定向，逡逑產(chǎn)生捕獲細(xì)菌微菌落以形成“侵染區(qū)室”（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｃｈａｍｂｅｒ）這種牧羊人鉤結(jié)構(gòu)逡逑ＯＭｆｉｅｚ邋ｅｔａｌ邋２０１７）。從這一點(diǎn)來(lái)看，根毛細(xì)胞膜內(nèi)陷并開(kāi)始向表皮細(xì)胞內(nèi)部伸長(zhǎng)，逡逑帶動(dòng)根瘤菌在侵染線內(nèi)部增殖并往下移動(dòng)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S541.6

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