【摘要】：實驗室前期研究表明,小麥(Triticum aestivum L.)胚乳發(fā)育需經(jīng)歷細胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)過程,淹水可加速其進程。為進一步揭示淹水脅迫下小麥胚乳細胞PCD進程提前的生理和細胞學(xué)機制,本實驗以華麥8號為材料,在開花當天對其進行淹水處理,從顯微和超微結(jié)構(gòu)水平研究了胚乳細胞中線粒體動態(tài)變化;采用免疫熒光、蛋白印跡等技術(shù)多角度研究了胚乳中細胞色素c釋放情況;利用實時定量PCR研究了胚乳中線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)組分相關(guān)基因的表達情況。另外,研究了抗環(huán)血酸、環(huán)孢菌素A和過氧化氫處理對耐濕品種華麥8號和不耐濕品種華麥9號生理生化和PCD進程的影響。研究結(jié)果表明:1.未淹水情況下,胚乳細胞超微結(jié)構(gòu)顯示,發(fā)育早期胚乳中線粒體結(jié)構(gòu)完整,內(nèi)嵴清晰,花后12 d線粒體輕微變形,內(nèi)嵴模糊,花后20 d大部分線粒體降解,僅在細胞邊緣處存在少量線粒體,結(jié)構(gòu)模糊。線粒體膜電位和膜吸光度檢測結(jié)果顯示,隨著胚乳細胞發(fā)育時間的延長線粒體膜電位膜降低,膜通透性增大,線粒體損傷加劇。淹水處理后,花后10 d胚乳細胞中部分線粒體明顯膨大,花后15 d胚乳細胞中大部分線粒體內(nèi)部出現(xiàn)電子透明區(qū)域,有被膜結(jié)構(gòu)包裹的未降解完全的線粒體存在;線粒體膜電位和膜吸光度低于同時期未淹水處理組。正常生長的小麥胚乳細胞中線粒體結(jié)構(gòu)隨著胚乳PCD的進行逐漸被破壞,淹水脅迫導(dǎo)致這種損傷加劇,時間提前。2.未淹水情況下,免疫熒光結(jié)果顯示,在花后10 d之前胚乳細胞中細胞色素c主要定位于線粒體上,花后12 d細胞色素c開始從線粒體釋放到胞質(zhì)中,花后15 d和花后20 d細胞色素c進一步釋放;超微細胞化學(xué)定位發(fā)現(xiàn),花后8 d細胞色素c主要集中在線粒體上,花后15 d在線粒體內(nèi)外均可檢測到細胞色素c的存在;蛋白印跡結(jié)果同樣顯示,花后12 d以后隨著胚乳細胞發(fā)育胞質(zhì)中細胞色素c含量逐漸增多。淹水脅迫下,免疫熒光和蛋白印跡結(jié)果都顯示,在花后10 d即可觀察到細胞色素c從線粒體釋放到胞質(zhì)中,并且釋放的細胞色素c含量高于同時期未淹水處理組。正常生長的小麥胚乳細胞中細胞色素c在花后12 d開始從線粒體釋放到胞質(zhì)中,而淹水脅迫下細胞色素c在花后10 d即開始從線粒體釋放,且釋放量大于同時期未淹水處理組。淹水脅迫導(dǎo)致細胞色素c釋放時間提前,釋放量增加。3.實時定量PCR結(jié)果顯示,未淹水情況下,小麥胚乳細胞中VDAC2表達量基本不變、VDAC3表達量先增加后降低、ANT1表達量逐漸降低,與蛋白折疊相關(guān)基因HSP70和HSP90表達量均先降低后增加。而淹水處理后VDAC2和VDAC3表達量均在花后8 d顯著增加,ANT1表達量在花后10 d達到峰,HSP70和HSP90基因表達量均低于未淹水對照組。MPTP可能參與淹水脅迫促進胚乳細胞PCD過程的調(diào)節(jié),而蛋白折疊障礙可能在其中承擔一部分作用。4.使用外源H_2O_2處理后,與未進行藥物處理對照組相比,華麥8號胚乳細胞中H_2O_2和O~(2-)含量上升,SOD和CAT活性增加,線粒體膜透性增加,細胞色素c釋放增多,caspase-like蛋白酶活性上升;華麥9號中變化趨勢類似,但與華麥8號相比較,細胞中O~(2-)積累更多、CAT活性上升幅度較小。使用外源抗環(huán)血酸處理后,華麥8號和華麥9號中H_2O_2含量均降低。使用外源環(huán)孢菌素A處理后,部分抑制了H_2O_2處理導(dǎo)致的ROS含量上升、線粒體膜透性增加、細胞色素c釋放增多和caspase-like蛋白酶活性上升等現(xiàn)象。以上結(jié)果說明,外源H_2O_2處理加劇了小麥胚乳細胞PCD,且華麥9號在遭遇外界脅迫后胚乳中ROS積累更多,抗氧化酶系統(tǒng)較弱,可能是其不耐濕的機制之一。綜上所述,淹水處理加劇小麥胚乳細胞中線粒體損傷和細胞色素c釋放,可能是淹水導(dǎo)致胚乳細胞PCD加劇和進程提前的原因之一。線粒體在正常生長和淹水脅迫下小麥胚乳細胞PCD的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。華麥9號胚乳中ROS累積多以及抗氧化系統(tǒng)弱,可能是其不耐濕的原因之一。
【圖文】：

圖 1 細胞程序性死亡主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Gupta et al 2006）Fig.1 The major signal transduction pathways for programmed cell death（Gupta et al 2006）1.4.1 死亡受體途徑細胞表面的死亡受體（Death receptor）家族包括 8 種，它們共同的特點是具相似的、富含半胱氨酸的細胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)死亡區(qū)域（Death domain）（Ashkenaand Dixit 1998）。外界信號因子通過與相關(guān)配體結(jié)合使其發(fā)生寡聚化及結(jié)構(gòu)的改變暴露出能與銜接蛋白結(jié)合的胞內(nèi)死亡區(qū)域，聚集并激活銜接蛋白（caspase8 等）引發(fā)下游 caspases 的活化并最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生（Ashkanazi and Dixi 1998）另外，激活的 caspase8 可以催化 Bid 的切割（Bcl-2 家族的促凋亡分子），作用于粒體外膜，在其他相關(guān)的 Bcl-2 家族成員的參與下誘導(dǎo)線粒體外膜通透性增加，，而促進細胞色素 c 的釋放，最終導(dǎo)致細胞死亡（Kantari and Walczak 2011）。

3.1 淹水脅迫對小麥胚乳細胞 PCD 進程的影響不同發(fā)育時期的未淹水處理和淹水處理的小麥胚乳 Evans Blue 染色結(jié)果（圖 2），隨著胚乳細胞的發(fā)育，染色反應(yīng)加深。8 DAF，在未淹水處理（對照淹水處理的小麥胚乳中都未觀察到被染色的死亡胚乳細胞，且對照較淹水處理麥籽粒更飽滿（圖 2A1, B1）。10 DAF，在未淹水處理和淹水處理的小麥胚乳未觀察到明顯染色反應(yīng)（圖 2 A2, B2）。12 DAF，未淹水處理的小麥胚乳中才出現(xiàn)少量染成藍色的死亡細胞（圖 2A3），而淹水處理組中有較多染成深藍色亡細胞（圖 2 B3）。15 DAF，未淹水處理的胚乳中可觀察到明顯的藍色，有更乳細胞死亡（圖 2A4），而淹水處理組中染色加深，染色細胞數(shù)量增加（圖 2 上述結(jié)果說明，未淹水處理的小麥胚乳經(jīng)歷了一個 PCD 過程，淹水脅迫導(dǎo)致胚胞程序性死亡進程提早，死亡數(shù)量較對照增加。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1

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本文編號：2614623