黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉屬真菌中的一個(gè)常見菌種,既是重要的工業(yè)發(fā)酵菌種,同時(shí)也是導(dǎo)致糧食和果蔬霉變的致病性真菌。真菌病原體侵染植物體時(shí),植物宿主細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)防御機(jī)制如活性氧自由基的爆發(fā)來限制病原菌的生長(zhǎng),同時(shí)病原菌會(huì)激活體內(nèi)的抗氧化酶類和抗氧化物質(zhì),確保自身不會(huì)受到植物免疫應(yīng)答帶來的損傷,抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)在菌植互作中的機(jī)制研究一直是學(xué)者關(guān)注的課題。cbsA(An05g00160)和cysA(An12g09880)是黑曲霉中分別編碼胱硫醚-β-合成酶和半胱氨酸合成酶的基因,它們與生物體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)半胱氨酸、H₂S的代謝密切相關(guān),但在抗氧化及菌植互作中所起到的作用尚不清楚。本文以黑曲霉為實(shí)驗(yàn)材料,利用同源重組的技術(shù)原理,構(gòu)建黑曲霉cbsA和cysA敲除載體,用PEG轉(zhuǎn)化黑曲霉原生質(zhì)體,通過基因組PCR和qRT-PCR的方法鑒定得到突變菌株ΔcbsA和ΔcysA。以突變菌株ΔcbsA和黑曲霉A.niger MA70.15(野生型)為材料開展以下工作。首先,在正常培養(yǎng)條件下,cbsA缺失不影響黑曲霉的生長(zhǎng)而在GMM(缺乏氨基酸)培養(yǎng)基上生...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 黑曲霉概述
    1.2 生物體內(nèi)胱硫醚-β-合成酶概述
    1.3 生物體內(nèi)半胱氨酸合成酶概述
    1.4 半胱氨酸和H₂S的生理功能概述
        1.4.1 半胱氨酸的生理功能
        1.4.2 H₂S的生理功能
    1.5 課題研究的目的、意義及內(nèi)容
        1.5.1 課題研究的目的和意義
        1.5.2 課題研究的主要內(nèi)容
第二章 黑曲霉cbsA與cysA缺失載體的構(gòu)建和突變菌株的篩選
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 溶液的配制
        2.1.4 培養(yǎng)基配制
        2.1.5 主要設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 構(gòu)建黑曲霉基因cbsA和cysA缺失載體
        2.2.2 黑曲霉原生質(zhì)體制備及聚乙二醇轉(zhuǎn)化
        2.2.3 黑曲霉突變菌種的篩選及鑒定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 cbsA和cysA上下游片段AB、CD的克隆、純化及連接
        2.3.2 pC3質(zhì)粒的雙酶切及cbsA和cysA的 PCR鑒定
        2.3.3 黑曲霉cbsA和cysA缺失體的基因組PCR鑒定
        2.3.4 黑曲霉cbsA和cysA缺失體的qPCR鑒定
第三章 黑曲霉cbsA的功能研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 胱硫醚-β-合成酶的生物信息學(xué)分析
        3.2.2 黑曲霉突變體ΔcbsA生長(zhǎng)狀況的觀察
        3.2.3 GMM培養(yǎng)基中黑曲霉的生長(zhǎng)狀況
        3.2.4 黑曲霉體內(nèi)Cys、GSH、H₂S含量的檢測(cè)
        3.2.5 黑曲霉菌絲體在不同非生物脅迫下的生長(zhǎng)情況
        3.2.6 黑曲霉菌體孢子萌發(fā)情況的觀察
        3.2.7 黑曲霉突變體ΔcbsA對(duì)采后果實(shí)侵染能力的檢測(cè)
        3.2.8 黑曲霉侵染后梨中ROS和MDA含量的檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 黑曲霉cbsA的生物信息學(xué)分析
        3.3.2 cbsA基因的缺失對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響
        3.3.3 氨基酸缺乏培養(yǎng)基對(duì)野生型菌株和ΔcbsA突變體生長(zhǎng)的影響
        3.3.4 cbsA基因缺失對(duì)黑曲霉半胱氨酸,谷胱甘肽和硫化氫含量的影響
        3.3.5 不同非生物脅迫對(duì)野生型菌株和ΔcbsA突變體生長(zhǎng)的影響
        3.3.6 鎘脅迫下對(duì)野生型菌株和ΔcbsA突變體生長(zhǎng)的影響
        3.3.7 黑曲霉對(duì)中國白梨的侵染能力分析
        3.3.8 黑曲霉侵染梨果實(shí)后ROS代謝的變化
    3.4 討論與小結(jié)
第四章 黑曲霉cbsA原核表達(dá)載體的構(gòu)建與酶學(xué)性質(zhì)研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        4.1.1 菌體、載體及植株
        4.1.2 培養(yǎng)基的配制
        4.1.3 試劑和儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 引物設(shè)計(jì)
        4.2.2 黑曲霉和番茄RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 目的基因cbsA,CS和CSX1 的克隆及線性載體的構(gòu)建
        4.2.4 重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與鑒定
        4.2.5 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定
        4.2.6 重組質(zhì)粒的二次轉(zhuǎn)化(DE3)
        4.2.7 cbsA,CS和CSX1 的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測(cè)定
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 cbsA,CS和CSX1的克隆及線性化載體的制備
        4.3.2 cbsA,CS和CSX1 大腸桿菌菌落鑒定和質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        4.3.3 cbsA,CS和CSX1 的測(cè)序鑒定
        4.3.4 cbsA,CS和CSX1 大腸桿菌的菌落鑒定
        4.3.5 大腸桿菌中重組基因的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.3.6 蛋白cbsA,CS和CSX1 酶活的檢測(cè)
第五章 黑曲霉cysA基因功能研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 半胱氨酸合成酶的生物信息學(xué)分析
        5.2.2 不同非生物脅迫條件下黑曲霉菌株的生長(zhǎng)分析
        5.2.3 cysA基因的缺失對(duì)黑曲霉半胱氨酸合成酶活性及半胱氨酸含量的影響
        5.2.6 黑曲霉菌體內(nèi)多種編碼半胱氨酸合成酶基因的表達(dá)水平分析
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 真菌中半胱氨酸合成酶基因的生物信息學(xué)分析
        5.3.2 cysA基因缺失對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的影響
        5.3.3 氨基酸缺乏培養(yǎng)基對(duì)野生型菌株和ΔcysA突變體生長(zhǎng)的影響
        5.3.4 不同非生物脅迫對(duì)黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突變體生長(zhǎng)的影響
        5.3.5 黑曲霉MA70.15(WT)和ΔcysA突變體對(duì)果實(shí)的侵染能力
        5.3.6 cysA基因缺失對(duì)黑曲霉半胱氨酸合酶活性和半胱氨酸含量的影響..
        5.3.7 cysA基因缺失對(duì)黑曲霉中編碼半胱氨酸合酶的其他基因表達(dá)的影響
    5.4 討論與小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
    蛋白電泳相關(guān)溶液配制
    黑曲霉ΔcysA和WT在不同濃度的非生物脅迫的生長(zhǎng)
攻讀碩士學(xué)位期間的學(xué)術(shù)活動(dòng)及成果情況
    1)參加的學(xué)術(shù)交流與科研項(xiàng)目
    1)發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3738275