儲(chǔ)糧霉變是造成糧食減損和品質(zhì)下降的重要原因之一�；揖G曲霉是典型的低水分活度下活動(dòng)的腐生霉菌,常被看作儲(chǔ)糧早期霉變的“警示菌”。研究發(fā)現(xiàn),Puroindoline蛋白（簡稱PIN蛋白）能夠有效抑制許多植物病原菌的生長,對(duì)細(xì)菌和霉菌都具有明顯的抗性。本課題組前期從小麥中克隆到Pina基因并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。本文以此原核系統(tǒng)中表達(dá)純化出的重組蛋白PINA（rPINA）為研究對(duì)象,考察其對(duì)主要儲(chǔ)糧霉菌的抑菌作用及抑菌效果穩(wěn)定性,著重研究了該重組蛋白對(duì)灰綠曲霉的抑菌效果和作用方式。主要研究結(jié)果如下:研究了重組蛋白PINA對(duì)白曲霉、黑曲霉、棕曲霉、禾谷鐮刀菌和鏈格孢霉等五種常見儲(chǔ)糧霉菌的抑菌作用。結(jié)果顯示:在PDB培養(yǎng)基中,0.334 mg/m L重組蛋白PINA可在12 h內(nèi)完全抑制白曲霉、黑曲霉、棕曲霉和禾谷鐮刀的孢子萌發(fā),部分抑制并延遲鏈格孢霉的孢子萌發(fā);以PDA為培養(yǎng)基,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí),0.334 mg/mL重組蛋白PINA可顯著抑制上述五種霉菌的菌絲生長。其中,對(duì)黑曲霉、禾谷鐮刀菌和白曲霉的抑制率分別達(dá)到73.68%、89.13%和74.5%。對(duì)黑曲霉和棕曲霉的產(chǎn)孢能力也表現(xiàn)... 

【文章來源】：河南工業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PINA蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖[68]

河南工業(yè)大學(xué)學(xué)位論文13依據(jù)同樣的方法測(cè)定重組蛋白PINA對(duì)白曲霉、棕曲霉、鏈格孢霉和禾谷鐮刀菌菌絲的生長抑制效果。抑制率（%）=對(duì)照（空白）組菌落直徑處理（實(shí)驗(yàn)）組菌落直徑對(duì)照空白組菌落直徑X100%2.3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，然后利用軟件SPSS22.0進(jìn)行方差分析，p<0.01表示極顯著，p<0.05表示顯著。2.4結(jié)果與分析2.4.1重組蛋白PINA的表達(dá)純化及WesternBlot檢測(cè)本課題組前期將已構(gòu)建的Pina基因的原核表達(dá)載體（PET28（+）+GST-Pina）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行外源表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃，IPTG終濃度達(dá)到9.6mg/mL，培養(yǎng)時(shí)間為12h的誘導(dǎo)條件下，較空白組而言，經(jīng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌株全細(xì)胞在電泳圖43KDa-55KDa區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)了一條明顯的蛋白條帶（圖2-1），表明重組基因在大腸桿菌中已獲得了表達(dá)[76]。圖2-1重組蛋白PINA的SDS-PAGE分析[76]Fig2-1SDS-PAGEanalysisofrPINA泳道M：蛋白質(zhì)Maker；泳道1：空質(zhì)粒全細(xì)胞蛋白；泳道2：轉(zhuǎn)化PET28（+）+GST-Pina融合載體大腸桿菌全細(xì)胞蛋白；泳道3：轉(zhuǎn)化PET28（+）+GST-Pina融合載體大腸桿菌破碎后的上清液；泳道4：轉(zhuǎn)化PET28（+）+GST-Pina融合載體大腸桿菌破碎后的沉淀

第二章重組蛋白PINA對(duì)主要儲(chǔ)糧霉菌的抑制作用14隨后對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后以包涵體為主要存在形式的重組蛋白進(jìn)行純化，最終得到可溶性重組蛋白PINA，如圖2-2所示，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化后的蛋白液中存在一條分子量在44KDa的蛋白條帶與蛋白的預(yù)期分子量基本一致。圖2-2純化后的重組PINA蛋白SDS-PANGE凝膠電泳分析[76]Fig2-2SDS-PANGEanalysisofpurifiedrPINA泳道M：蛋白質(zhì)Maker；泳道1：空質(zhì)粒全細(xì)胞蛋白；泳道2：轉(zhuǎn)化PET28（+）+GST-Pina融合載體大腸桿菌破碎后的上清液；泳道3：轉(zhuǎn)化PET28（+）+GST-Pina融合載體大腸桿菌破碎后的沉淀；泳道4-5：純化后的重組蛋白PINAWesternBlot檢測(cè)結(jié)果如圖2-3所示，經(jīng)純化后的蛋白液僅有一條明顯的特異性蛋白條帶，表明已構(gòu)建的Pina基因的原核表達(dá)載體特異性表達(dá)了重組蛋白PINA。本文作者采用課題組前期研究所得的此重組蛋白PINA，進(jìn)行下述對(duì)儲(chǔ)糧霉菌的抑制作用及其穩(wěn)定性的相關(guān)研究。圖2-3Blot檢測(cè)重組蛋白PINA[76]Fig2-3WesternBlotdetectionofrPINA泳道M、N:蛋白質(zhì)Maker；泳道1-3:重組蛋白PINA

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[4]人工合成抗菌肽抑制棉花黃萎病菌的機(jī)制及應(yīng)用研究[D]. 倪密.浙江大學(xué) 2012

碩士論文
[1]小麥赤霉病菌Rab互作溶酶體蛋白對(duì)DON毒素生物合成的影響[D]. 朱麗紅.河南工業(yè)大學(xué) 2019
[2]抗菌肽mastoparan-S,thanatin和ponericin W1對(duì)柑橘果實(shí)酸腐病的控制效果與機(jī)制研究[D]. 劉莎.西南大學(xué) 2019
[3]小麥PINA蛋白體外表達(dá)及其抗黃曲霉作用研究[D]. 呂昂.河南工業(yè)大學(xué) 2019
[4]儲(chǔ)藏稻谷中霉菌的生長演替規(guī)律及霉變稻谷的品質(zhì)研究[D]. 周濤.武漢輕工大學(xué) 2018
[5]銀杏活性成分對(duì)蘋果鏈格孢霉抑制作用的研究[D]. 徐志超.大連工業(yè)大學(xué) 2018
[6]雞LEAP-2抗菌肽基因的克隆及蛋白的表達(dá)和純化[D]. 李鄒.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[7]竹紅菌甲素對(duì)番茄灰霉菌的抑制作用[D]. 李朋舉.浙江農(nóng)林大學(xué) 2014
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