多環(huán)芳烴(PAHs)是我國(guó)污染土壤中最常見的一類具有“致畸、致癌、致突變”效應(yīng)的持久性有機(jī)污染物,可以被植物吸收積累,并通過食物鏈危害農(nóng)產(chǎn)品安全和人群健康。如何減低污染區(qū)植物PAHs污染一直備受關(guān)注。近年來,利用具有PAHs降解功能的植物內(nèi)生細(xì)菌來去除污染區(qū)植物PAHs已成為農(nóng)業(yè)環(huán)境領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。功能內(nèi)生細(xì)菌能夠有效地定殖在目標(biāo)植物體內(nèi),促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植物的耐受性,促進(jìn)植物體內(nèi)PAHs代謝。然而,功能內(nèi)生細(xì)菌定殖對(duì)植物體內(nèi)土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和PAHs降解相關(guān)酶系活性有何影響?國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究仍很薄弱。闡明這一重要科學(xué)問題有助于豐富和完善功能內(nèi)生細(xì)菌減低植物PAHs污染的作用機(jī)制。本論文選用實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選的一株具有菲降解功能的內(nèi)生細(xì)菌Pn2(Massilia sp.),在明確了其對(duì)抗生素的抗性以及產(chǎn)植物促生物質(zhì)情況的基礎(chǔ)上,利用溫室盆栽試驗(yàn),研究了菌株P(guān)n2定殖對(duì)小麥(Triticum aestivum L.cv.Yangmai-16)生長(zhǎng)和吸收積累菲的影響;探討了定殖菌株P(guān)n2后小麥體內(nèi)土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和PAHs降解相關(guān)酶系活性的變化。主要研究成果如下:1.闡明了功能內(nèi)生細(xì)菌Pn2定殖對(duì)小麥吸收積累菲的影響。功能內(nèi)生細(xì)菌Pn2定殖降低了小麥體內(nèi)菲含量、積累量以及從根向莖葉的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。采用抗生素抗性標(biāo)記技術(shù)對(duì)功能菌株P(guān)n2進(jìn)行標(biāo)記,其中Pn2對(duì)低濃度的氨芐青霉素(20mg·L-1)和氯霉素(20mg·L-1)有抗性。利用這兩種抗性作為菌株P(guān)n2的篩選標(biāo)記,采用灌根的定殖方式將菌株P(guān)n2定殖到小麥體內(nèi)。結(jié)果表明,功能菌株P(guān)n2可以良好地定殖在小麥組織中,并通過產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)和鐵載體促進(jìn)小麥生長(zhǎng),提高小麥生物量。較高密度的菌株P(guān)n2定殖在小麥組織中能夠有效地降低植物體內(nèi)菲含量。例如,接種30 d后,小麥根部和莖葉部菌株P(guān)n2的定殖數(shù)量分別為3.74-4.53和2.88-3.38 log cfu·g-1FW;與不接菌對(duì)照相比,高密度的Pn2定殖促使小麥根和莖葉組織中菲去除率分別提高15.5%-28.4%和20.8%-30.6%。同時(shí),菌株P(guān)n2定殖也能夠提高污染土壤中菲的去除率。2.揭示了菌株P(guān)n2定殖對(duì)小麥體內(nèi)土著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。分別提取小麥根和莖葉中內(nèi)生細(xì)菌總DNA,采用IlluminaPE250測(cè)序技術(shù)研究了菲污染小麥組織中內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明,內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)取決于小麥組織中菲污染脅迫和外源功能內(nèi)生細(xì)菌Pn2的定殖。在不同菲污染水平下,小麥組織中內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群不盡相同,但變形菌門(Proteobacteria)和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)始終為優(yōu)勢(shì)種群。低(5mg·kg-1)、中水平(50mg·kg-1)菲污染強(qiáng)度下小麥體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌具有較高的豐富度和多樣性。功能菌株P(guān)n2定殖可提高小麥組織中內(nèi)生細(xì)菌的豐富度和多樣性。例如,低水平菲污染強(qiáng)度條件下,接種菌株P(guān)n2可以顯著提高小麥根和莖葉組織中內(nèi)生細(xì)菌的豐富度(p0.05)。然而,功能菌株P(guān)n2定殖只能部分改變小麥組織中內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。例如,接種菌株P(guān)n2后,小麥組織中厚壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度要高于不接菌對(duì)照組;小麥根中Pseudomonassp.的相對(duì)豐度要高于對(duì)照組,但小麥莖葉中Pseudomonas sp.的相對(duì)豐度則顯著低于對(duì)照組(p0.05)。3.探明了菌株P(guān)n2定殖對(duì)小麥體內(nèi)PAHs代謝酶系活性的影響。功能菌株P(guān)n2定殖可以影響小麥體內(nèi)PAHs代謝相關(guān)酶系活性。小麥體內(nèi)PAHs代謝酶系活性取決于小麥組織中菲含量和外源功能內(nèi)生細(xì)菌Pn2的定殖。在不接菌對(duì)照組中,菲脅迫使小麥組織中多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性先增強(qiáng)后減弱,且當(dāng)土壤中菲污染強(qiáng)度為50mg·kg-1時(shí),小麥組織中PPO和POD活性最高。接種功能菌株P(guān)n2后,小麥組織中PPO和POD活性都增強(qiáng)。例如,功能菌株P(guān)n2接種20d后,可以顯著提高小麥根部PPO活性(p0.05);而當(dāng)菌株P(guān)n2分別接種20d和40d后,可以顯著提高小麥根部POD活性(p0.05)。
【學(xué)位單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：X592;S154.3
【部分圖文】：

接種功能菌株Ｐｎ２降低了小麥體內(nèi)菲的含量，結(jié)果如表２－５所示。為了進(jìn)一步表逡逑征菌株Ｐｎ２對(duì)小麥體內(nèi)菲降解的作用，引入了促進(jìn)效率（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ邋ｒａｔｉｏ，邋Ｅ，％）逡逑的概念。如圖２－１，邋２０邋ｄ時(shí)，小麥根部菌株Ｐｎ２的促進(jìn)效率分別為２６．７７％、１７．３１％、逡逑１７．４１％，小麥莖葉部菌株Ｐｎ２的促進(jìn)效率分別為２７．７３％、３７．４８％、３１．０８％：邋３０邋ｄ時(shí)，逡逑小麥根部菌株Ｐｎ２的促進(jìn)效率分別為２３．３４％、２８．４％、１５．５０％，小麥莖葉部菌株Ｐｎ２逡逑的促進(jìn)效率分別為３０．６０％、２８．５０％、２０．８０％；邋４０邋ｄ時(shí)，小麥根部菌株Ｐｎ２的促進(jìn)效逡逑率分別為１９．６８％、３３．０２％、２８．８７％，小麥莖葉部菌株Ｐｎ２的促進(jìn)效率分別為３２．３１％、逡逑２３逡逑

２．２．６邋Ｐｎ２定殖對(duì)土壤中菲去除的影響逡逑接種菌株Ｐｎ２不僅能夠促進(jìn)小麥體內(nèi)菲的降解代謝，也可以降低根際土壤中菲的逡逑污染濃度。通過圖２－２可以看出，同一菲污染強(qiáng)度下，接菌處理組（ＣＰＢ）邋土樣中菲逡逑殘留量比對(duì)照組（ＣＰ）低；２０邋ｄ后，ＣＰＢ處理組土樣中菲含量相對(duì)于ＣＰ處理組減逡逑少了邋２１．３３％、１０．２３％、１６．９％；邐３０ｄ后，ＣＰＢ處理組土樣中菲含量相對(duì)于ＣＰ處理逡逑組減少了邋１５．４２％、１７．６１％、１７．９５％；邐４０ｄ后，ＣＰＢ處理組土樣中菲含量相對(duì)于ＣＰ逡逑處理組減少了邋２７．３９％、２０．８６％、２０．２７％。此外，功能菌株Ｐｎ２接種３０邋ｄ后，土壤中逡逑菲的殘留濃度顯著低于對(duì)照組＜０．０５）。以上結(jié)果表明接種功能內(nèi)生細(xì)菌Ｐｎ２對(duì)土逡逑壤中菲的去除起到了促進(jìn)作用。逡逑２５逡逑

４．２．１邋Ｐｎ２定殖對(duì)小麥體內(nèi)多酚氧化酶活性的影響逡逑隨著菲污染強(qiáng)度的提高，小麥根部和莖葉部ＰＰＯ活性先增大后減少；且當(dāng)菲污染逡逑濃度為５０邋ｍｇ邋ｋｇ－１時(shí)小麥根部和莖葉部中ＰＰＯ活性最高（圖４－１、４－２、４－３）。結(jié)果表逡逑明在一定濃度的菲污染強(qiáng)度可以誘導(dǎo)小麥體內(nèi)ＰＰＯ的活性提高，相反的當(dāng)菲污染強(qiáng)度逡逑超過閾值，就會(huì)降低小麥體內(nèi)ＰＰＯ活性。逡逑—１５００「ａ未接菌ＣＰ邐ｂ邐３０００「□來接菌ＣＰ逡逑＇ｊｃ邐□接菌邋ＣＰＢ邋N邐？邐□接菌邋ＣＰＢ逡逑？邋１２００邋－邐ａｂ此W 邐．目逡逑＞邐ｊＩ邐ｆ邋２４００邐－邐ｃ逡逑－９00邋．邋ａｂ｜｜邋曜邐＃rP猓r』ｂ3Z牽rP蓿rPx預(yù)岕邐￡１８°�！鲥澹遅 ■邋ｉ逡逑？穴邐ＴｒＩ＿邋ｉ邋§邋眉邋ａｂ邐W邋W 邐：截邐ａ邋ｉ逡逑ｒ°．ｆ｜邐｜邐＿邐卜■！邐Ｉ邐Ｉ邋＿逡逑益ｉ３°°邋…震：ｌ邐＿邋＿邐圈：ｉ邋：媝逡逑Ｓ邐．邐\dW邐WX詠⿱p逡逑0邋Ｉ邋ｆ屈》Ｉ邋Ｂ邋？邋Ｉ坦邋？邋Ｉ．因》邐■邋圈邋眉逡逑0邋邋邋ｒｎｉ邋Ｉ邋邋ｔｅａ邋ｉ邋邋ｒｒｄ邋ｉ邋邋邋ｉ逡逑Ｓ0邋５１邐５２邐８３邐ＳＯ邋Ｓ！邐Ｓ２邋Ｓ３逡逑圖４－１種植２０天后小麥體內(nèi)多酚氧化酶活性（Ｕ邋ｇ＋ｍｉｒｖ１）逡逑Ｆｉｇ．邋４－１邋Ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ＰＰＯ邋ｉｎ邋ｗｈｅａｔ邋ｒｏｏｔｓ邋ａｎｄ邋ｓｈｏｏｔｓ邋ｐｌａｎｔｅｄ邋ｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗ－ｂｒｏｗｎ邋ｓｏｉｌ逡逑ａｆｔｅｒ邋２０邋ｄａｙｓ邋（Ｕ邋ｇ＇＾ｍｉｎ１）逡逑接種功能菌株Ｐｎ２提高了小麥體內(nèi)ＰＰＯ活性。例如：功能菌株Ｐｎ２接種２０邋ｄ后，逡逑可以顯著提高小麥根部ＰＰＯ活性（ｐ＜邋０．０５）。表４－１顯示

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