【摘要】：納米銀(AgNPs)是應(yīng)用最廣泛的商品化納米材料之一,近年來消費(fèi)品中含有AgNPs的數(shù)量和比例增加,隨AgNPs生產(chǎn)制造、使用及廢棄的過程使其不可避免的進(jìn)入陸生系統(tǒng)之中。AgNPs擁有良好的長效廣譜抗菌作用,對(duì)多種微生物具有強(qiáng)烈抑制作用。土壤氮素轉(zhuǎn)化過程主要由土壤微生物介導(dǎo),當(dāng)AgNPs進(jìn)入土壤環(huán)境后對(duì)土壤微生物的活性造成損傷。AgNPs作為新型污染物質(zhì)進(jìn)入農(nóng)田環(huán)境中,對(duì)土壤微生物、作物氮素利用均會(huì)造成一定程度的影響,其中由硝化細(xì)菌所介導(dǎo)的土壤硝化反應(yīng)對(duì)AgNPs均有高度敏感性。研究調(diào)查AgNPs在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化、化學(xué)特性及毒理作用是監(jiān)控及治理新型土壤污染物的必要手段,探討AgNPs對(duì)土壤微生物的抑制機(jī)理以及對(duì)氮素轉(zhuǎn)化微生物和相關(guān)功能基因表達(dá)量的影響,對(duì)治理和緩解釋放到土壤環(huán)境中的AgNPs所產(chǎn)生的危害提出具體的指導(dǎo)方向。本研究在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下,采用批量處理實(shí)驗(yàn)方法探討AgNPs暴露對(duì)土壤微生物多樣性、土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物過程、AgNPs對(duì)土壤微生物抑制機(jī)理以及AgNPs對(duì)土壤氮初級(jí)轉(zhuǎn)化速率的影響進(jìn)行研究。通過實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下基于Illumina測序平臺(tái)研究了暴露在AgNPs環(huán)境中對(duì)土壤微生物多樣性的影響;探究土壤AgNPs對(duì)土壤氨化、硝化作用強(qiáng)度的影響,并采用實(shí)時(shí)熒光定量(Real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction Detecting System,QPCR)擴(kuò)增儀測定AgNPs對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵功能基因拷貝數(shù)的影響;研究AgNPs對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物活性的抑制機(jī)理,采用氨氧化細(xì)菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonaseuropeae作為研究對(duì)照,比較不同劑量、尺寸及釋放Ag~+對(duì)N.europeae活性的影響;基于~(15)N同位素稀釋技術(shù)研究在AgNPs對(duì)土壤氮初級(jí)硝化速率、土壤氮初級(jí)礦化速率的影響,并測定AgNPs對(duì)土壤無機(jī)氮肥及有機(jī)氮肥轉(zhuǎn)化、酶活性的影響。本文為AgNPs新型污染物所導(dǎo)致的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變、土壤氮循環(huán)的影響及肥料利用提出量化分析結(jié)果的參考。本文主要研究結(jié)果如下:1.采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的方式將土壤分別暴露在AgNPs含量為10、50、100 mg/kg的環(huán)境中28℃培養(yǎng)7 d,采用氯仿熏蒸及土壤誘導(dǎo)呼吸的方式測定AgNPs對(duì)土壤微生物生物量氮和活性的影響,并通過提取土壤細(xì)菌總DNA采用Illumina測序平臺(tái)對(duì)V4區(qū)域進(jìn)行土壤微生物群落多樣性分析。研究結(jié)果表明,土壤暴露在AgNPs環(huán)境中抑制土壤微生物的活性,當(dāng)AgNPs含量分別為10、50、100 mg/kg時(shí),空白對(duì)照組土壤微生物生物量氮含量分別高于AgNPs處理組33.0%、58.7%、71.1%;空白對(duì)照組誘導(dǎo)呼吸量高于AgNPs處理組1.17%、17%、29.3%,即低劑量AgNPs暴露條件下對(duì)土壤誘導(dǎo)呼吸量抑制不顯著。土壤微生物多樣性研究結(jié)果分析表明,在屬分類水平土壤AgNPs暴露劑量和所檢測出細(xì)菌類群的種類呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),但優(yōu)勢門類檢測數(shù)量基本一致。不同劑量AgNPs暴露下對(duì)土壤微生物主導(dǎo)菌群門類(變形菌門Proteobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria)不產(chǎn)生顯著作用,變形菌門群落豐度百分比與土壤AgNPs含量呈正相關(guān),酸桿菌門、放線菌門的群落豐度百分比與AgNPs含量呈負(fù)相關(guān)。高劑量AgNPs暴露下土壤微生物群落中的α-、β-、γ-、δ-變形菌綱豐度在細(xì)菌綱水平豐度高于對(duì)照組。酸桿菌綱發(fā)育分類下的目、科、屬在各分類水平群落豐度百分比均屬于絕對(duì)優(yōu)勢豐度菌群,且各發(fā)育水平下的群落豐度百分比和土壤AgNPs劑量呈負(fù)相關(guān)。2.實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下研究AgNPs對(duì)土壤硝化作用強(qiáng)度,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)測定AgNPs對(duì)土壤硝化功能基因amoA、Arch-amoA基因拷貝數(shù)的影響;利用氨氧化細(xì)菌模式菌株歐洲亞硝化毛桿菌Nitrosomonas europeae研究AgNPs對(duì)土壤硝化細(xì)菌活性抑制的機(jī)理,將N.europeae接種到含有不同劑量、尺寸AgNPs的培養(yǎng)基中探究對(duì)細(xì)菌抑制程度的影響。研究結(jié)果表明,土壤暴露在AgNPs環(huán)境中對(duì)土壤硝化作用產(chǎn)生抑制,土壤硝化反應(yīng)的抑制程度和AgNPs暴露劑量呈正相關(guān),其中土壤AgNPs含量分別為50mg/kg和100 mg/kg時(shí)AgNPs對(duì)該暴露劑量下的土壤硝化作用抑制率組間差異不顯著。土壤AgNPs暴露劑量分別為10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg時(shí),AgNPs對(duì)土壤微生物硝化功能基因amoA基因表達(dá)量的抑制率分別為34.4%、68.8%和91.8%,即土壤AgNPs含量100 mg/kg時(shí)對(duì)硝化作用抑制率極顯著。N.europeae接種到含AgNPs(50 nm)的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)其亞抑制作用的濃度范圍為5-10 mg/L,且在此濃度范圍培養(yǎng)5-8 h時(shí)AgNPs對(duì)細(xì)菌所產(chǎn)生抑制率下降,即在此培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)N.europeae細(xì)胞活性緩慢恢復(fù);當(dāng)N.europeae暴露在AgNPs劑量為20 mg/L的培養(yǎng)基中時(shí)對(duì)細(xì)菌活性抑制率高達(dá)77%,且抑制率不隨培養(yǎng)時(shí)間變化。采用流式細(xì)胞(FCM)技術(shù)測定不同劑量、粒徑AgNPs對(duì)N.europeae細(xì)胞致死率的影響,結(jié)果表明AgNPs(50 nm)所釋放出的Ag~+導(dǎo)致細(xì)胞壞死率占該劑量AgNPs所引起細(xì)胞壞死率的45%;通過透射電鏡-能譜儀(TEM-EDS)檢測發(fā)現(xiàn)AgNPs粒子可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,與細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密吸附結(jié)合造成細(xì)胞損傷;在同劑量下AgNPs粒子的尺寸越小,導(dǎo)致的細(xì)胞壞死率越高,小粒徑AgNPs在低劑量時(shí)能顯著影響細(xì)胞壞死率。3.通過稀釋平板計(jì)數(shù)法測定AgNPs暴露下土壤可培養(yǎng)氨化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌的數(shù)量,并測定AgNPs對(duì)蛋白酶活性、土壤反硝化功能基因nos Z基因拷貝數(shù)的影響;將反硝化模式菌株反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中,探究AgNPs對(duì)反硝化細(xì)菌的影響。研究結(jié)果表明,暴露在AgNPs環(huán)境中的土壤可培養(yǎng)氨化細(xì)菌數(shù)量及蛋白酶活性均受到抑制,可培養(yǎng)氨化細(xì)菌數(shù)量及酶活性抑制程度與土壤AgNPs暴露劑量呈正相關(guān)。AgNPs對(duì)土壤可培養(yǎng)反硝化細(xì)菌數(shù)量、nosZ基因拷貝數(shù)均未產(chǎn)生顯著抑制作用,即土壤反硝化細(xì)菌對(duì)AgNPs具有強(qiáng)烈的抗性。反硝化無色桿菌Achromobacter denitrificans和施氏假胞單菌Pseudomonas stutzeri分別接種到含AgNPs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,當(dāng)培養(yǎng)基中AgNPs劑量為5 mg/L時(shí)通過掃描電鏡(SEM)觀察到兩種菌體表面均形成緊密的莢膜,且此劑量下對(duì)細(xì)菌生長無抑制作用;當(dāng)培養(yǎng)基中AgNPs劑量為20 mg/L時(shí),兩種菌體表面形成緊致的莢膜層,且通過透射電鏡(TEM)觀察到Achromobacter denitrificans的細(xì)胞膜完整,對(duì)細(xì)菌生長抑制不顯著。4.實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下批量實(shí)驗(yàn)處理,測定AgNPs劑量分別為10、50、100mg/kg時(shí)土壤硝酸還原酶、亞硝酸還原酶隨時(shí)間酶活性的變化;通過施加無機(jī)氮肥CO(NH_2)_2、(NH_4)_2SO_4、KNO_3探究AgNPs對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化酶活性的影響;在AgNPs暴露下的土壤分別施加秸稈和豬糞,探究AgNPs對(duì)土壤有機(jī)氮肥轉(zhuǎn)化的影響;基于~(15)N稀釋技術(shù)測定不同劑量AgNPs暴露下對(duì)土壤氮初級(jí)硝化速率及礦化速率的影響。研究結(jié)果表明,當(dāng)土壤暴露在AgNPs的培養(yǎng)條件下時(shí),硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性與土壤AgNPs暴露劑量呈負(fù)相關(guān)。土壤AgNPs含量為10 mg/kg時(shí),硝酸還原酶活性未受抑制;當(dāng)土壤AgNPs含量100 mg/kg時(shí),硝酸還原酶活性抑制顯著。土壤AgNPs暴露劑量為50 mg/kg和100 mg/kg時(shí),硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性與對(duì)照組相比抑制顯著,但處理組間抑制程度相當(dāng)。通過施加無機(jī)氮肥CO(NH_2)_2、(NH_4)_2SO_4可促進(jìn)暴露在AgNPs環(huán)境中土壤脲酶的活性,其酶活性依舊受到AgNPs的抑制作用;暴露于AgNPs環(huán)境中的土壤施加KNO_3、CO(NH_2)_2對(duì)硝酸還原酶均有一定促進(jìn)作用;施加CO(NH_2)_2及(NH_4)_2SO_4在未添加AgNPs及低劑量AgNPs(10 mg/kg)處理土壤中,對(duì)亞硝酸還原酶活性無顯著促進(jìn)作用;AgNPs暴露條件下的土壤,施加KNO_3促進(jìn)羥胺還原酶活性。在土壤AgNPs暴露劑量為100mg/kg的條件下分別施加秸稈和豬糞,暴露在AgNPs環(huán)境下的土壤NH_4~+-N、NO_3~--N含量均低于分別僅施加秸稈和豬糞的處理組土壤,即AgNPs抑制土壤分解細(xì)菌的活性,使得有機(jī)氮肥施加后不易被分解成無機(jī)氮。在培養(yǎng)初期2 h-3 d時(shí),土壤氮初級(jí)硝化速率及土壤氮初級(jí)礦化速率和AgNPs暴露劑量呈負(fù)相關(guān);培養(yǎng)后期的部分培養(yǎng)時(shí)間段AgNPs處理組轉(zhuǎn)化速率略高于對(duì)照組。在2 h-1 d培養(yǎng)時(shí)間段,土壤空白對(duì)照組的氮初級(jí)礦化速率分別高于土壤AgNPs含量為10 mg/kg、50 mg/kg和100 mg/kg的9.3%、22.63%和34%,氮初級(jí)礦化速率分別高于24.1%、62.3%和82.2%。在AgNPs暴露下的土壤施加NH_4NO_3,土壤中NO_3~--N含量與AgNPs劑量呈負(fù)相關(guān),表明AgNPs劑量和土壤硝化作用抑制率呈正相關(guān)。施加NH_4NO_3使對(duì)照組及AgNPs劑量為10 mg/kg土壤amoA和Arch-amoA基因拷貝數(shù)增加,AgNPs劑量為50 mg/kg和100 mg/kg時(shí)其基因拷貝數(shù)受AgNPs抑制而數(shù)量減少。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TB383.1;S154.3
【圖文】：

圖 1-1AgNPs 進(jìn)入土壤環(huán)境后的遷移轉(zhuǎn)化[31]Fig.1-1 The entry, transport, and fate of engineered nanoparticles in environmentAgNPs 的溶解對(duì)很多生物體均會(huì)產(chǎn)生毒性，如細(xì)菌、無脊柱動(dòng)物、部分魚類和人體某些器官及細(xì)胞[32]，但毒性作用的大小和 AgNPs 的劑量呈正相關(guān)，另外AgNPs 膠體穩(wěn)定性、生物可利用性、化學(xué)性質(zhì)的變化及在土壤環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化均是影響對(duì)生物體毒性大小的原因[33]。AgNPs 遷移行為很大程度上依賴土壤介質(zhì)遷移轉(zhuǎn)化和 AgNPs 形態(tài)，例如 PVP 包被 AgNPs 的遷移性和 pH、陽離子交換量、有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，而鐵氧化物、鈣和鉀使得 AgNPs 遷移能力減弱[34]。納米材料因比表面積大，易被其他物質(zhì)吸附導(dǎo)致在環(huán)境中更加容易被遷移，大多數(shù)膠體表面為負(fù)電荷和帶正電荷的納米材料產(chǎn)生靜電吸引和配位體交換。土壤中存在溶解態(tài)有機(jī)質(zhì)如胡敏酸和富里酸，這些有機(jī)物使得 AgNPs 膠體穩(wěn)定性增加[33,35]，胡敏酸包被的納米材料具有空間穩(wěn)定性并吸附腐殖質(zhì)酸增加滲透力[36]。胡敏酸包被的納米氧化物很容易在溶液中懸浮分散[37]，但 AgNPs 在胡敏酸包被時(shí)穩(wěn)定性增加，減少在土壤介質(zhì)中遷移轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[33]。納米材料在土壤環(huán)境的遷移、沉積受到

圖 1-2 納米顆粒對(duì)細(xì)胞毒理的不同作用機(jī)制Fig 1-2 Schematic representation of bacterial cell with different potential interactions of engineered nanoparticles andmodes of toxicity[31]AgNPs 的抑菌機(jī)理被認(rèn)為和氧化應(yīng)激有關(guān)，但氧化應(yīng)激反應(yīng)也能引起細(xì)菌的促炎反應(yīng)。AgNPs 在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)均可能產(chǎn)生 ROS，其產(chǎn)物羥基自由基被認(rèn)為是導(dǎo)致白念珠菌 Candida albicans 線粒體功能失調(diào)，細(xì)胞凋亡的重要原因[70]。Ag+介導(dǎo)下對(duì)細(xì)胞的呼吸鏈造成干擾增加 ROS 產(chǎn)生量，其主要誘導(dǎo)產(chǎn)生形式是超氧游離基而不是 H2O2[71]。AgNPs 所引起氧化應(yīng)激反應(yīng)影響可由細(xì)胞關(guān)鍵蛋白表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估。通過添加維他命 C（VitC）和 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可減輕由 AgNPs 所引起的氧化損傷[72]。經(jīng)過 NAC 預(yù)處理人體肺部上皮細(xì)胞 A549 可以減少 AgNPs 對(duì)細(xì)胞抑制能力，而且會(huì)改變基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）活性，同時(shí)也證明了 AgNPs 對(duì)細(xì)胞的毒性是通過依賴誘導(dǎo)產(chǎn)生 ROS 的途徑作用[73]。另外研究證實(shí)，維他命 C 也能減少 AgNPs 造成慢性骨髓性白血病細(xì)胞的毒性[74]，這些研究結(jié)果都表明了 AgNPs 誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的過程中氧化損傷起到了重要作用。

圖 2-1 透射電鏡觀察 AgNPs 形態(tài)（50 nm）Fig. 2-1 Transmission Electron Microscope (TEM) images of silver nanoparticles (50 nm)土壤 DNA 提取采用試劑盒 FastDNATMSPIN Kit for soil，購于美國 MP 公司。膠回收試劑盒：TakaraAgarose Gel DNAFragment Recovery Kit Ver.2.0無乙醇氯仿：氯仿與水按體積比 1:2 裝入分液漏斗中，搖晃混勻 1 min 后釋放出底層氯仿放置在燒杯中，洗滌三次。純化后的氯仿儲(chǔ)備在玻塞棕色瓶中，避光 4℃保存。0.5 mol/L K2SO4溶液：87.10 g K2SO4溶于 1000 mL 去離子水定容。乙酸鋰（LiOH·H2O）溶液：168 g LiOH·H2O 加入 279 mL 優(yōu)級(jí)純冰乙酸溶解并加水定容至 1000 mL，用 50%（w/v）NaOH 溶液或者濃鹽酸調(diào)節(jié) pH 至 5.2。茚三酮溶液：50 mL 乙酸鋰溶液和 150 mL 二甲基亞砜（C2H6OS）混合后分別加入 0.12 g 還原茚三酮（C18H10O6·2H2O）和 4 g 水合茚三酮（C9H4O3·H2O）攪拌至溶解。0.1 mol/L 硫酸銨[(NH4)2SO4]標(biāo)準(zhǔn)液：(NH4)2SO4105℃干燥 2h 后放置在干燥皿

【參考文獻(xiàn)】

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