【摘要】：銹赤扁谷盜Cryptolestesferrugineus(Stephens)是一種重要的儲糧害蟲,對主要熏蒸劑一磷化氫的抗藥性發(fā)展迅速,已經成為制約儲糧安全的重要因素。本研究采用FAO推薦的方法,測定不同地理種群C.ferrugineus的抗性水平;基于C ferrugineus轉錄組測序的數(shù)據庫信息,采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)以及快速擴增cDNA末端(RACE)技術克隆獲得CPR家族6個表皮蛋白基因的全長序列,利用生物信息學方法分析其核苷酸序列和蛋白質序列;在篩選C.ferrugineus不同發(fā)育階段和不同品系最適內參基因的基礎上,研究了 4個線粒體基因的表達模式,以此探索C.errugineus的磷化氫抗性機制。研究結果如下:1.銹赤扁谷盜的磷化氫抗性水平測定采用FAO推薦的抗性測定方法對張家港、成都和太倉的C.ferrugineus種群進行磷化氫毒力測定,結果表明張家港種群(ZJGCF)的LC50為0.079mg/L,抗性系數(shù)(Rf)最低,為7.18倍,屬低抗性種群;成都種群(CDCF)的LC50為0.126mg/L,抗性系數(shù)(Rf)為11.45倍,屬中等抗性種群;太倉種群(TCCF)的LC50為20.975 mg/L,抗性系數(shù)為1906.82倍,屬極高抗性種群。2.銹赤扁谷盜CPR家族表皮蛋白基因的克隆及序列分析基于C.ferrugineus的轉錄組數(shù)據庫信息,利用RT-PCR、RACE技術克隆獲得了CPR家族的6條表皮蛋白基因的全長序列,分別命名為C1-C6,進而用生物信息學方法分析了各基因結構和序列特征并進行蛋白質同源性分析。Cferrugineus的CPR家族表皮蛋白基因序列的分析數(shù)據見表3.2,各基因序列長度分別為C1=704bp、C2=794bp、C3=771 bp、C4=796bp、C5=630bp、C6=711 bp,都具有典型的polyA結構;各基因成熟蛋白序列長度在137～176個氨基酸之間;等電點在4.56～7.10之間;蛋白分子量在14.51～17.81KDa之間;C1具有CPR家族表皮蛋白典型的RR保守結構域:CHIT_BIND_RR_2;C2～C6具有CPR家族表皮蛋白典型的RR保守結構域:CHIT_BIND_RR_1和CHIT_BIND_RR_2;各蛋白都具有幾丁質結合區(qū)域:Chitin_bind_4;各表皮蛋白均具有信號肽序列,長度為16-18個氨基酸;6個CPR家族表皮蛋白都屬于mix型;6個CPR家族表皮蛋白都屬于親水型;C1、C3、C4、C6蛋白都存在跨膜區(qū)域,為跨膜蛋白;C2、C5蛋白不存在跨膜區(qū)域,為非跨膜蛋白;同源性分析發(fā)現(xiàn)獲得的氨基酸與其他物種的表皮蛋白具有較高的同源性。3.銹赤扁谷盜內參基因的篩選及驗證使用geNorm,NormFinder,Bestkeeper和deltaCt 4種軟件評價了銹赤扁谷盜9個內參基因(α-TUB,CycA,EF1α,γ-TUB,GAPDH,RPL13α,RPS13,SDA,β-ACT)在不同發(fā)育階段和不同品系中的最佳內參基因及其組合。結果表明,在不同發(fā)育階段表達最穩(wěn)定的內參基因RPS13+EF1a,最不穩(wěn)定的是α-TUB;不同品系在磷化氫脅迫下表達最穩(wěn)定的基因是RPS13+γ-TUB,最不穩(wěn)定的是GAPDH和Cyc4。4.磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體基因的表達模式研究利用qRT-PCR方法檢測不同品系Cferrugine.s的4個線粒體基因nad3,atp6,cob,cox1的表達模式,結果表明:在未熏蒸條件下,nad3、atp6、cob基因在敏感品系和抗性品系中的表達量有顯著差異(P0.05),其中nad3在敏感品系中的表達量是抗性品系的753.29倍,atp6在敏感品系中的表達量是抗性品系的1479.01倍,cob在敏感品系中的表達量是抗性品系的5756.93倍;而cox1在敏感品系和抗性品系中的表達量差異不顯著(P0.05)。此外,在磷化氫誘導下,隨著時間的延長,nad3、atp6、cob在敏感品系和抗性品系中的表達量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,而cox1在敏感品系和抗性品系中的表達量均未出現(xiàn)顯著變化。以上表明nad3、atp6、cob可能參與了C.ferrugi C.s對磷化氫抗性的形成。
【學位授予單位】：南京財經大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S379.5
【圖文】：

２．１．２．２抗性n,定逡逑參照ＦＡＯ（１９７５）推薦的排水集氣裝置收集ＰＨ３氣體，裝置自制，ＰＨ３氣體由逡逑磷化鋅和１０％的硫酸反應制備而得，發(fā)生裝置見圖２．１。逡逑ＰＨ３氣體濃度用ＰＨ３￥體檢測O)進行測定。逡逑采用ＦＡＯ（１９７５）推薦的方法，并稍作改動。實驗時設定５個濃度梯度（死亡逡逑率在１６％－８４％的濃度范圍，通過預實驗確定）和１個空白對照，３次重復。先把逡逑試蟲放入熏蒸瓶，用高真空硅脂把熏蒸瓶與玻璃旋塞密封。用合適量程的氣密性逡逑注射器抽取一定體積的ＰＨ３氣體，熏蒸瓶上的橡膠、塞注入熏蒸瓶內，輕輕搖勻，逡逑置于２５°Ｃ、７０％邋ＲＨ的培養(yǎng)箱中密閉熏蒸２０邋ｈ。打開玻璃旋塞，在通風櫥中散氣逡逑１２逡逑

圖３．３邋６個ＣＰＲ家族表皮蛋白跨膜區(qū)域預測逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ａｎａｌｙｓｉ?

圖３．４銹赤扁谷盜６個ＣＰＲ家族表皮蛋白ｃＤＮＡ及相應的氨基酸序列逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．４邋Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ａｎｄ邋ｄｅｄｕｃｅｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｓｉｘ邋ｃｕｔｉｃｕｌａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｏｆ邋ＣＰＲ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｉｎ逡逑Ｃ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ逡逑信號肽用下劃線標出．逡逑Ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．逡逑

【參考文獻】

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本文編號：2750881