【摘要】：Latrophlin(lph)是蛛毒素受體,先前的研究顯示其具有藥物敏感性。lph下游基因囊泡轉(zhuǎn)運蛋白(vacht)、乙醛脫氫酶3家族B1成員(aldh3b1)和葡萄糖醛酸酶(gusb)廣泛存在昆蟲中,并且vacht其功能涉及神經(jīng)遞質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、可作為藥物開發(fā)靶點。Aldh3b1功能涉及乙醇代謝和解毒代謝。Gusb其功能涉及哺乳動物體內(nèi)的異源物質(zhì)代謝和化學(xué)農(nóng)藥降解。但在昆蟲中關(guān)于這三個基因本身生物學(xué)功能、與昆蟲殺蟲劑敏感性的關(guān)系和如何參與lph下游功能調(diào)控等暫時都還未有相關(guān)闡述。因此,研究vacht、aldh3b1和gusb的功能不僅能揭示這三個基因的本身功能也為昆蟲對殺蟲劑抗性機制的研究提供理論依據(jù),還能為lph下游解毒信號通路闡述奠定基礎(chǔ)。本文通過實時熒光定量PCR鑒定了 lph下游vacht、aldh3b1和gusb三個基因在lph敲除后的表達量,發(fā)現(xiàn)vacht、aldh3b1和gusb在lph缺失后都顯著下調(diào)表達。為了探究lph調(diào)控下游這三個基因藥物應(yīng)激過程。我們選取這三個顯著下調(diào)表達的基因進一步探究他們在藥物敵敵畏和克百威處理下7個時間點的表達模式。結(jié)果顯示,敵敵畏和克百威處理后都會誘導(dǎo)vacht、aldh3b1和gusb上調(diào)表達,表明lph下游的這三個基因都能參與藥物應(yīng)答。但這三個基因的對藥物應(yīng)達模式不一致,暗示這三個基因在參與藥物應(yīng)答方面有自己的單獨機制。并且干擾這三個基因后用半致死濃度藥物處理,比起對照組,干擾組幼蟲死亡率明顯上升,表明vacht、aldh3b1和gusb具有藥物敏感性和殺蟲劑抗性。為了探究這三個基因如何參與lph下游殺蟲劑抵抗性,我們用半致死濃度藥物處理抑制lph表達的幼蟲,后定量ds-lph組中vacht、aldh3bl和gusb表達量,結(jié)果顯示vacht上調(diào)表達,aldh3b1和gusb下調(diào)表達。暗示雖然這三個基因都在lph下游,但vacht僅在lph通路中起作用,aldh3b1和gusb在lph缺失后還能上調(diào)表達,表明aldh3b1和gusb可能還在別的信號通路中參與調(diào)控殺蟲劑抵抗性,該通路很可能對lph起補償作用。我們對vacht、aldh3b1和gusb做進一步生理功能分析。首先,這三個基因的時空表達模式分析顯示他們在不同的發(fā)育時期和組織中都可表達。對幼蟲期vacht干擾導(dǎo)致產(chǎn)卵量下降30%,所有后代都不能孵化且ACh和vg表達量與對照組相比發(fā)生降低。表明vacht降低后通過降低ACh含量進一步阻礙昆蟲羽化和生殖。且vacht降低會影響營養(yǎng)信號通路中乙酰輔酶A的胞外攝取,進而影響VG合成,進而影響生殖。aldh3b1和gusb干擾后對生長發(fā)育沒有影響但vg表達量與對照組相比發(fā)生降低。猜測有其它生殖信號通路參與調(diào)控aldh3bl和gusb對生殖的影響來恢復(fù)二者降低對生殖的影響�？傊�,本文鑒定了lph下游基因vacht、aldh3b1和gusb本身殺蟲劑抵抗性和生理功能,還為lph信號通路的鑒定提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S379.5
【圖文】：

圖２．４．１／ｐ／；下游基因ＲＮＡ－ｓｅｑ數(shù)據(jù)驗證逡逑注：ＷＴ：野生型；丨Ｂ：注射生理溶液ｂｕｆｆｅｒ的昆蟲：ｄｓ－／／＞／？，為注射／ａ／ｒａ／？Ｗ／？ｄｓ－ＲＮＡ的逡逑昆蟲。每個實驗組�。持挥紫x提取總ＲＮＡ，然后各樣品�。担埃埃睿缒孓D(zhuǎn)錄成ｃＤＮＡ，通過逡逑ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測基因敲減水平，內(nèi)參基因為／ｔｍＪ基因。Ｐ＜０．００１表示具有極顯著差異逡逑（＊＊＊）。逡逑２．４．２邋Ｆｉａｃ／＂、和時空和組織表達模式分析逡逑通過實時熒光定量ＰＣＲ技術(shù)，對赤擬谷盜中０／７下游ｖａｃ／／／、0／辦％７和逡逑ｇｗＭ三基因進行時期表達模式的分析。由圖２．４．２－１可以看出來，３個基因在八逡逑個發(fā)育時期中都有表達。以Ｃ／７／基因在早期幼蟲和晚期成蟲都高表達（圖Ａ），逡逑ｆｌＷＷＷ在早期成蟲高表達（圖Ｂ），也在早期成蟲高表達（圖Ｃ）。幼蟲逡逑和成蟲這兩個階段是赤擬谷盜的大量攝食階段，暗示著這兩個基因可能參與解逡逑毒；這三個基因的時期表達為后續(xù)進一步探究這三個基因的功能提供了實驗依逡逑據(jù)。逡逑

蟲、ＥＰ邋（ｅａｒｌｙ邋ｐｕｐａｅ）為邋１邋天的踴、ＬＰ邋（ｌａｔｅ邋ｐｕｐａｅ）為邋６邋天的踴、ＥＡ邋（ｅａｒｌｙ邋ａｄｕｌｔ）為邋１邋天逡逑的成蟲、ＬＡ邋（ｌａｔｅ邋ａｄｕｌｔ）為２０天的成蟲；／７７５Ｊ作為內(nèi)參基因。逡逑另外，對這三個基因也進行了組織表達模式分析，如圖２Ａ２－２，邋除了逡逑頭部高表達外，在其它組織中都表達量很低，而頭部是重要的解毒器官，暗示逡逑ｖｆｌｄ；／除在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用外，可能還具有代謝解毒的功能（圖Ａ）。逡逑的組織表達顯示，該基因在與代謝解毒相關(guān)的表皮中有較高表達水平，說明逡逑與抗性有著密切的關(guān)系（圖Ｃ），在組織表達中并沒有顯示與解毒逡逑相關(guān)功能，但這并不能排除其可能與藥物敏感性功能相關(guān)，畢竟，該實驗只是逡逑是為后續(xù)實驗提供了一個預(yù)測。．逡逑Ａ邋１２０１邋ｖａｃｈｔ邐Ｄ邋３0ｉ邋ａＷ＞＞３４），邐５ｉ邋ｇｕｓｂ逡逑１邋．邋Ｊｎ邐Ｕ邋１邋２５．邐Ｔ邐｜逡逑＾邋６０．邋ｉ邐十邐Ｉ４．邐［＋１邐？逡逑１邋？邐ｌｉｅ：邐ｌ３＇邐丁逡逑Ｉ邋４0邐｜邋５邐Ｉ２邋＊逡逑°ｌｎ．．ｉ？ｎｎｎ□邋＾邋ｊｎ邋１１ｎｎｎｎｎ逡逑Ｗ邐一、？｜夢、少、＞Ｖ邐少ｖ％、

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