【摘要】：煙草根際生活著種類繁多的微生物,這些微生物對于改變土壤肥力水平和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)起到了至關(guān)重要的作用,其中的有益微生物與煙草之間經(jīng)過長期的協(xié)同進(jìn)化,形成了許多生理機(jī)制,來促進(jìn)彼此的生長發(fā)育。本研究從煙草K326根際分離篩能分泌鐵載體的促生菌株Sm-1,16S rDNA鑒定結(jié)果表明,該菌株為草螺菌屬細(xì)菌(Herbaspirillum spp.);隨后通過高效液相色譜法分離和純化了sm-1分泌的鐵載體,并通過質(zhì)譜和核磁波譜法對其進(jìn)行了表征。為了獲得更高產(chǎn)量的鐵載體,本論文還通過Plackett-Burman法優(yōu)化了Sm-1產(chǎn)鐵載體的發(fā)酵條件。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.采用稀釋涂布平板法從煙草K326根際分離得到6株外觀形態(tài)有顯著性差異的促生菌,根據(jù)CAS藍(lán)色平板檢測法篩選出分泌鐵載體能力最強(qiáng)的菌株Sm-1,并通過16S rDNA鑒定得出Sm-1菌株與草螺菌(Herbaspirillum spp.)的16S rDNA序列相似度達(dá)到99%。2.采用SM低鐵培養(yǎng)基,通過中試發(fā)酵獲得了Sm-1的50 L發(fā)酵液�；诟咝б合嗌V法分離和純化Sm-1分泌的鐵載體,編號分別為Sm-1-1-2-1、Sm-1-1-2-2和Sm-1-1-3-1,純度達(dá)到98%以上。采用質(zhì)譜法和核磁共振波譜法對純化得到的3個(gè)物質(zhì)進(jìn)行表征分析,結(jié)果表明:Sm-1-1-2-1、Sm-1-1-2-2和Sm-1-1-3-1的分子量分別為162.0461、444.1596和444.1592。3.以SM培養(yǎng)基為對照,采用Plackett-Burman優(yōu)化法對Sm-1菌株設(shè)計(jì)了17因素,N=20的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對影響Sm-1菌株鐵載體分泌量的主要因素進(jìn)行篩選,結(jié)果表明:鈣離子和硫酸根離子對Sm-1菌株鐵載體分泌量的影響最顯著,維生素B_1是最主要的誘導(dǎo)因子,C源和N源的對Sm-1菌株鐵載體的分泌量無明顯影響,其他因素影響不顯著,優(yōu)化后的Sm-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基成分為硫酸鈣0.3 g,維生素B_1 1.5 g,天冬氨酸1.5g,磷酸氫二鉀3.0 g,琥珀酸1.5 g,硫酸鎂0.3 g,超純水1 L。優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)Sm-1菌株后的發(fā)酵液在CAS藍(lán)色平板上形成的橙黃色暈圈(3.6 cm)明顯大于SM培養(yǎng)基(3.0 cm),說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)Sm-1菌株能使其產(chǎn)生更多鐵載體�？傮w來說,Sm-1菌株具有很強(qiáng)的分泌鐵載體的能力,經(jīng)16S rDNA鑒定其為草螺菌屬細(xì)菌(Herbaspirillum spp.)。缺鐵培養(yǎng)基能誘導(dǎo)Sm-1菌株分泌鐵載體,通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分能使Sm-1菌株在低成本的前提下分泌盡可能多的鐵載體,提高產(chǎn)量。采用高效液相色譜法可以對Sm-1菌株分泌的鐵載體進(jìn)行分離純化,從而得到純的鐵載體單體,有利于今后研究鐵載體與植物相互作用機(jī)理,鐵載體對重金屬的螯合機(jī)制。本論文的研究成果可為煙草根際促生菌外泌鐵載體在促進(jìn)煙草生長和植煙土壤重金屬污染的生物防治等方面的研究提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐,在提高煙草產(chǎn)質(zhì)量和保護(hù)土壤生態(tài)安全等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

性[45]。鐵載體的另一個(gè)重要作用是礦物風(fēng)化，從而有利于大量營養(yǎng)元中，如P, Ca和N等，改善植物和微生物的礦質(zhì)營養(yǎng)[46, 47]。鐵載體緩解ACC脫氨酶的合成，從而降低植物根圍ACC水平，，并將ACC轉(zhuǎn)移到土A是植物和微生物產(chǎn)生的一種生長激素，研究表明重金屬脅迫能極大氧化降解，從而抑制植物的生長。有報(bào)道稱Cd和Cu處理的豌豆苗中化，而鐵載體的存在能降低這一過程[49, 50]。而鐵載體在Al3+, Cd2+, Cu2金屬離子的降解中陸續(xù)被報(bào)道，土壤微生物及其分泌的鐵載體與植物互作用如圖 1-1 所示。

2.3.1 煙草根際促生菌的分離結(jié)果通過稀釋涂布平板法分離 K326煙草根際的促生菌，涂布在 LB 平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h 后，觀察細(xì)菌生長情況，如圖2-1。仔細(xì)觀察對比不同菌落的形態(tài)、大小、顏色和表面光滑程度等，發(fā)現(xiàn)總共有6種外觀典型不同的菌落。圖 2-1 煙草 K326 根際產(chǎn)鐵載體促生菌的分離Fig.2-1 The separation of K326 tobacco rhizosphere endophytic bacteria secreting siderophore對分離得到的6種菌落分別劃線純化，每一種菌落隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落在 LB 平板上劃線（如圖2-2）。挑取單菌落接種至 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，然后與體積濃度為50%的無菌甘油混合于2 mL PE 管，密封，-80 ℃保存，并進(jìn)行編號。圖 2-2 煙株 K326 根際促生菌的純化Fig.2-2 The purification of K326 tobacco rhizosphere endophytic bacteria
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S572;S154.3

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本文編號：2657249