【摘要】：昆蟲鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑以及新型高效殺蟲劑茚蟲威和氰氟蟲腙的作用靶標(biāo)。基因重復(fù)是真核生物新基因起源和基因功能分化的重要途徑。目前大多數(shù)昆蟲基因組中只發(fā)現(xiàn)一個鈉離子通道基因,但我們前期的研究發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜基因組中鈉離子通道發(fā)生基因重復(fù),產(chǎn)生了 TcNavl和TcNav2兩個基因。本論文在此基礎(chǔ)上,克隆了 TcNav2的全長序列,比較了 TcNav1和TcNav2的序列同源性、系統(tǒng)發(fā)生、基因組結(jié)構(gòu)以及選擇性剪接位點(diǎn),利用實(shí)時熒光定量PCR、RNA干擾等分子生物學(xué)技術(shù)分析TcNav1和TcNav2在赤擬谷盜不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)模式及其毒理學(xué)、生物學(xué)功能差異。研究結(jié)果在提高對昆蟲鈉離子通道功能與進(jìn)化認(rèn)識的同時,也為新型殺蟲劑的創(chuàng)制提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:克隆了赤擬谷盜Ⅱ型鈉離子通道基因TcNav2全長cDNA序列,并對TcNav1和TcNav2的序列和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了比較分析。通過反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)克隆了赤擬谷盜Ⅱ型鈉離子通道基因全長cDNA序列,命名為TcNav2。TcNav2開放閱讀框長6114bp,編碼2037個氨基酸殘基。TcNavl和TcNav2氨基酸序列的一致性為86%。TcNavl和TcNav2與para氨基酸序列的一致性分別為76.1%和75.5%。系統(tǒng)發(fā)生分析也表明,TcNav1和TcNav2與其它昆蟲鈉離子通道基因聚為一支。TcNav1和TcNav2基因結(jié)構(gòu)相似包括4個同源結(jié)構(gòu)域(Ⅰ-Ⅳ),每個結(jié)構(gòu)域含6個跨膜片段(S1-S6)�；駾EKA(功能是決定離子選擇性,位于同源結(jié)構(gòu)域 S5 和 S6 連接環(huán))在 TcNav1(D387,E988,K1492,A1785)和 TcNav2(D376,E975,K1483,A1776)中高度保守。比較了赤擬谷盜鈉離子通道重復(fù)基因TcNav1和TcNav2的基因組結(jié)構(gòu)和選擇性剪接位點(diǎn)。TcNav1和TcNav2基因組序列都含有26個外顯子與25個內(nèi)含子,對應(yīng)于TcNav1基因,TcNav2基因的8號和9號外顯子合并為一個外顯子;對應(yīng)于TcNav2基因,TcNav1基因的18號和19號外顯子合并為一個外顯子。TcNav1和TcNav2基因的外顯子序列一致性為59.1～98.9%。TcNav1與TcNav2基因的26個外顯子中,共有18個外顯子長度一致,同時內(nèi)含子平均長度幾乎相同,分別為169bp和166bp�；蚪M中內(nèi)含子大多符合GT-AG規(guī)則,但也有一些內(nèi)含子為其他類型,例如GC-AG形式。在TcNav2基因中,對應(yīng)著黑腹果蠅para的選擇性剪接位點(diǎn)j和f,外顯子1的3'端與外顯子14的5'端發(fā)生外顯子跳躍和選擇性剪接;對應(yīng)于para選擇性剪接位點(diǎn)a和i存在于所有克隆中。內(nèi)含子25發(fā)現(xiàn)于多個cDNA中,表明發(fā)生內(nèi)含子保留。明確了赤擬谷盜鈉離子重復(fù)基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)量差異。用RT-qPCR檢測TcNav1和TcNav2基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)。結(jié)果表明,TcNav1和TcNav2基因均在頭部的表達(dá)水平最高,而卵巢、胸部、中腸、馬氏管和脂肪體的表達(dá)水平無顯著差異。TcNav1和TcNav2基因在頭部的表達(dá)有顯著性差異,但在其他組織中無顯著性差異。發(fā)育表達(dá)模式顯示,TcNav1在1日齡幼蟲的mRNA水平明顯高于其他齡期階段。各階段TcNav1的mRNA水平均明顯高于TcNav2。構(gòu)建了有效的赤擬谷盜鈉離子重復(fù)基因RNA干擾體系。對20日齡幼蟲或1日齡蛹注射了靶向 TcNav1或 TcNav2 的特異性 siRNA(siRNA-TcNav1 和 siRNA-TcNav2)。注射后24h、48h、72h、96h、120h用qPCR檢測其干擾效果。結(jié)果表明,注射24小時后,TcNav1的轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制74%,而注射72小時后,TcNav2的轉(zhuǎn)錄水平下降了 60%。注射siRNA-TcNav1 和 siRNA-TcNav2 后 48h 和 72h 分別抑制了 70%和 86%的 TcNav1 和 TcNav2轉(zhuǎn)錄。此外,TcNav1-RNAi和TcNav2-RNAi對敲除其靶基因都具有高度選擇性,并且由于密切相關(guān)基因的mRNA水平?jīng)]有受到影響,因此沒有檢測到交叉干擾效應(yīng)。比較了赤擬谷盜鈉離子通道重復(fù)基因干擾后試蟲對藥劑的敏感性和對生長發(fā)育的影響。分別給20天的幼蟲注射siRNA-TcNav1或siRNA-Tcav2,注射后的第1天和第3天用溴氰菊酯和高效氯氰菊酯進(jìn)行生物測定,結(jié)果表明,與緩沖液處理的幼蟲相比,siRNA處理的幼蟲對溴氰菊酯的敏感性顯著下降。注射siRNA-TcNav1或siRNA-TcNav2的20日齡幼蟲化蛹明顯延遲,僅觀察到42%和63%的化蛹率,單獨(dú)注射緩沖液的幼蟲(對照組)在注射后觀察到74%的化蛹。對于成蟲羽化,單用緩沖液注射1日蛹后,羽化率達(dá)到90%,而注射siRNA-TcNav1或siRNA-TcNav2后,羽化率僅為75%和84%。
【圖文】：

邐＾邐＾邐＾逡逑圖４－１邐和及＿２基因在不同組織的相對表達(dá)量的比較逡逑所有的數(shù)據(jù)都是平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤；不同的字母表示存在顯著差異（Ｐ＜邋０．０５）；邋＊＊表示極顯著差異（Ｐ＜０．０１）逡逑Ｆｉｇ．４－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＴｃＮａｖｌ邋ａｎｄ邋ＴｃＮａｖ２邋ｉｎ邋６邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｃａｓｔａｎｅｕｍ．ＡＷ邋ｄａｔａ邋ｗｅｒｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎ士ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｄｅｖｉａｔｉｏｎ（ＳＤ）．邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ａｍｏｎｇ邋ｔｈｅ逡逑ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｔｉｍｅ邋ｐｏｉｎｔ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ｔｅｓｔ邋（Ｐ邋＜邋０．０５）．逡逑２．２邋ｒｄＶａＷ和ｒｃ〗Ｖａｖ２在赤擬谷盜不同發(fā)育階段的表達(dá)比較逡逑通過實(shí)時熒光定量ＰＣＲ分析了邋ＴｃｉＶａＷ和ｒｃＭ？ｖ２基因在赤擬谷盜的不同發(fā)育階段的表逡逑達(dá)情況。結(jié)果分析表明，ｒｄＶｏｖ／基因在１日幼蟲的表達(dá)量最高，卵期和蛹期的表達(dá)量都逐逡逑漸上升，幼蟲期和成蟲期的表達(dá)量逐漸下降。１日幼蟲與３日卵具有顯著性差異，其余發(fā)逡逑育階段無顯著性差異�；蛟冢等沼嫉谋磉_(dá)量最高，，在發(fā)育階段的表達(dá)量趨勢與逡逑ｒｄｖｉ基因基本相同，各發(fā)育階段的相對表達(dá)量無顯著性差異。和ｒｃＡＴｆｌＶ２基因在逡逑不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量差異較大，在１日幼蟲階段，７ｙｙ0Ｗ基因的表達(dá)量是ｒｃ７Ｖａｖ２逡逑基因的６８倍，差異最少發(fā)育階段是３日蛹期，相差十倍（詳見圖

Ａ邐Ｂ逡逑圖５－１．赤擬谷盜鈉離子通道重復(fù)基因干擾后的相對表達(dá)量（Ｌ２０）逡逑Ａ邋７ＷＶａｖ／基因干擾后的相對表達(dá)量；Ｂ邋７ｙＶｏｖ２基因干擾后的相對表達(dá)量逡逑所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，＊表示差異顯著（＊叩＜0．0１；邋＊＊叩＜0．00５）逡逑Ｆｉｇ．５－１．邋Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴｃＮａｖ邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋２０－ｄａｙ－ｏｌｄ邋Ｌａｒｖａｅ邋ｏｆ邋Ｔ．邋ｃａｓｔａｎｅｕｍ．（Ａ）Ｔ＼＼ｑ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ＴｃＮａｖｌ邋ｇｅｎｅ逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ＲＮＡｉ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｉＲＮＡ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．（Ｂ）Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ＴｃＮａｖ２邋ｇｅｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ逡逑ＲＮＡｉ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｓｉＲＮＡ邋ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．＊Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｂｙ邋ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡｔｅｓｔ邋（＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００５）逡逑２．１．２邋１日蛹（ＰＤ干擾效率測定逡逑選�。比沼�，進(jìn)行ｓｉＲＮＡ干擾。每只蛹的注射量為４００ｎＬ，濃度ｌｎｇ／叫。選取注射后逡逑１？３天的踴，通過ＲＴ－ｑＰＣＲ檢測千擾效率。結(jié)果表明，注射ｓｉＲＮＡ－：ＴｄＷ２ｄ后，ｒｃｉＶａｖ；逡逑的轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制７０％。注射ｓｉＲＮＡ－７ｆｃＭＴｖ２后３ｄ顯著抑制了邋８６％的７ｔＡ＾ｖ２轉(zhuǎn)錄。逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S379.5

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本文編號：2629196