發(fā)布時(shí)間：2020-04-10 03:15

【摘要】：銹赤扁谷盜Cryptodestes ferrugineus(Stephens)是世界上發(fā)生最為普遍的儲(chǔ)糧害蟲(chóng),銹赤扁谷盜的成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)主要以糧食的胚部為食,由于其繁殖能力強(qiáng),容易在糧庫(kù)里大量繁殖,對(duì)儲(chǔ)糧安全產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。由于磷化氫的長(zhǎng)期使用,加上施藥者在使用過(guò)程中的不規(guī)范操作,致使銹赤扁谷盜普遍產(chǎn)生了高抗性。普遍的抗藥性和銹赤扁谷盜種群猖獗,已成為當(dāng)前糧食儲(chǔ)藏中最為嚴(yán)峻的問(wèn)題。因此,研發(fā)新型的、對(duì)環(huán)境友好型的殺蟲(chóng)劑,已成當(dāng)務(wù)之急。幾丁質(zhì)主要存在于真菌的胞壁、甲殼類動(dòng)物的外殼和昆蟲(chóng)的體壁中,高等哺乳動(dòng)物不含有幾丁質(zhì),因此根據(jù)幾丁質(zhì)生物合成途徑研發(fā)新型殺蟲(chóng)劑已經(jīng)成為當(dāng)今熱點(diǎn)。本研究以銹赤扁谷盜為研究對(duì)象,利用RNAi技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)幾丁質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶-幾丁質(zhì)合成酶2(CHS2)基因的特性和功能進(jìn)行了深入的研究,為以后利用幾丁質(zhì)合成酶來(lái)防治銹赤扁谷盜提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。定蟲(chóng)隆作為一種幾丁質(zhì)合成抑制劑被廣泛應(yīng)用,而定蟲(chóng)隆對(duì)銹赤扁谷盜生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的影響,及可能的作用靶標(biāo)尚沒(méi)有系統(tǒng)性的研究。本研究以銹赤扁谷盜為對(duì)象,通過(guò)亞致死劑量的定蟲(chóng)隆處理銹赤扁谷盜,研究定蟲(chóng)隆對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響,及可能作用的靶標(biāo),為以后定蟲(chóng)隆用于儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的防治提供理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:一、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列與其他昆蟲(chóng)的CHS2基因進(jìn)行同源對(duì)比,找到保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增了銹赤扁谷盜CHS2基因的3個(gè)片段,利用DNAMAN軟件拼接后獲得了銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因完整的開(kāi)放閱讀框。將拼接得到的銹赤扁谷盜CHS2的基因序列翻譯成氨基酸,與赤擬谷盜等昆蟲(chóng)的氨基酸進(jìn)行同源對(duì)比,構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示銹赤扁谷盜的CHS2與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、馬鈴薯甲蟲(chóng)(Leptinotarsa decemlineata)、玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera)的CHS2蛋白親緣關(guān)系較近,命名該基因?yàn)镃fCSH2(GenBank登陸號(hào)MH234580)。采用NCBI中的ORF Finder軟件分析表明,其開(kāi)放閱讀框ORF包含4428bp,編碼1475個(gè)氨基酸。氨基酸序列沒(méi)有信號(hào)肽,有11個(gè)預(yù)測(cè)的糖基化位點(diǎn),包含了14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),說(shuō)明其編碼的蛋白是一個(gè)跨膜蛋白。其中的322(523-845)個(gè)氨基酸是幾丁質(zhì)合成酶的保守序列,含有幾丁質(zhì)合成酶特有的標(biāo)簽序列EDR和QRRRW。二、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的時(shí)空表達(dá)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)對(duì)銹赤扁谷盜不同發(fā)育階段幾丁質(zhì)合成酶2(CfCHS2)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明,CfCSH2在銹赤扁谷盜卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)不同發(fā)育階段均有表達(dá),但表達(dá)量差異顯著(P0.05)。幼蟲(chóng)階段CfCSH2在1齡的相對(duì)表達(dá)量最多,隨后逐漸減少,在蛹期表達(dá)量最低,卵期有少量表達(dá),成蟲(chóng)期最多。說(shuō)明了該基因在銹赤扁谷盜進(jìn)食期表達(dá)量較多,非進(jìn)食期表達(dá)量較少。CfCSH2在銹赤扁谷盜不同組織的表達(dá)量有顯著差異(P0.05)。在成蟲(chóng)表皮中基本不表達(dá),在頭部、胸部、脂肪體中有少量的表達(dá),腹部的表達(dá)量最高,其次是中腸,腹部的高表達(dá)量可能與其樣品體積較大,包含組織較多有關(guān)。三、銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶2基因的功能研究利用RNAi干擾技術(shù)研究了幾丁質(zhì)合成酶基因的功能及其對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。分別用體外注射和飼喂的方法在銹赤扁谷盜幼蟲(chóng)體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了CfCHS2基因的沉默。結(jié)果表明:無(wú)論使用注射還是飼喂的方法,RNA沉默后幼蟲(chóng)均出現(xiàn)軀體蜷縮,腹部干癟,無(wú)法正常爬行的現(xiàn)象。同時(shí)發(fā)現(xiàn)注射dsRNA的最佳干擾效率能達(dá)到64.83%,顯著高于飼喂組49.59%的干擾效率。持續(xù)飼喂7天后,實(shí)驗(yàn)組的死亡率達(dá)到63.33%,顯著高于對(duì)照組的6.67%。在持續(xù)飼喂dsRNA的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)CfCHS2出現(xiàn)過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象,CfCHS2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出先下降后上升再下降的現(xiàn)象,這說(shuō)明在CfCHS2被dsRNA沉默后,昆蟲(chóng)為了維持機(jī)體的穩(wěn)定,提高了機(jī)體CfCHS2的表達(dá)量,從而形成一種代償性增加的反饋機(jī)制。對(duì)RNAi處理后的銹赤扁谷盜的中腸進(jìn)行了甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)沉默CfCHS2基因后的幼蟲(chóng)中腸圍食膜缺失,腸道上皮細(xì)胞沒(méi)有圍食膜的保護(hù),不能附著在中腸橫肌,嚴(yán)重受損。這些結(jié)果說(shuō)明幾丁質(zhì)合成酶2在銹赤扁谷盜中腸圍食膜的形成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。CfCHS2基因的沉默會(huì)使銹赤扁谷盜發(fā)育受阻,導(dǎo)致死亡。實(shí)驗(yàn)選用納米殼聚糖作為傳遞載體,通過(guò)飼喂法使目的基因的表達(dá)量顯著下降,銹赤扁谷盜死亡率顯著升高,為以后基于RNAi技術(shù)防治銹赤扁谷盜提供了科學(xué)依據(jù)。四、定蟲(chóng)隆對(duì)銹赤扁谷盜生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其作用機(jī)理研究建立了定蟲(chóng)隆對(duì)銹赤扁谷盜作用的毒力方程:y=7.514+1.81x,r=0.974,計(jì)算得LD50為0.041 mg/kg,95%置信區(qū)間為0.025~0.059mg/kg;亞致死劑量LD_(10)、LD_(20)、LD_(30)分別為0.008mg/kg、0.014mg/kg、0.021mg/kg。另外研究發(fā)現(xiàn)亞致死劑量定蟲(chóng)隆處理能夠顯著延長(zhǎng)銹赤扁谷盜生長(zhǎng)發(fā)育的歷期,體重顯著下降(P0.05)。經(jīng)定蟲(chóng)隆LD_(30)長(zhǎng)期處理的銹赤扁谷盜,體重可下降25%。低劑量的定蟲(chóng)隆就可以導(dǎo)致銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)含量顯著下降(P0.05),說(shuō)明定蟲(chóng)隆對(duì)銹赤扁谷盜的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的抑制作用,可以用于儲(chǔ)糧害蟲(chóng)銹赤扁谷盜的防治。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用LD_(30)定蟲(chóng)隆處理銹赤扁谷盜三齡幼蟲(chóng)CfCHS1基因的表達(dá)量明顯上調(diào),是對(duì)照組的1.787倍。CfCHS2基因的表達(dá)量也明顯上調(diào),是對(duì)照組的1.274倍。推測(cè)定蟲(chóng)隆的作用靶標(biāo)是銹赤扁谷盜幾丁質(zhì)合成酶,其抑制了CHS酶活性,使CHS不能正常的進(jìn)行幾丁質(zhì)的合成。
【圖文】：

蟲(chóng)幾丁質(zhì)概述質(zhì)（chitin）又叫甲殼素，是自然中分布最廣泛、儲(chǔ)存量?jī)H次于在昆蟲(chóng)體內(nèi)，幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用形成昆蟲(chóng)的表皮，，并且中腸圍食膜重要的結(jié)構(gòu)成分[24]，這些能使昆蟲(chóng)在生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)素對(duì)昆蟲(chóng)的侵害[25]。昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)與變態(tài)發(fā)育都依賴了幾丁質(zhì)結(jié)質(zhì)是由 N-乙�；�-D-葡糖胺通過(guò)β-1,4-糖普鍵連接而形成的高聚N)n，結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖 1。它存在 3 種不同的晶體形態(tài):α-幾丁質(zhì)、β一種形態(tài)均具有不同的生物化學(xué)特征。α-幾丁質(zhì)剛性最強(qiáng)，在它主要存在于昆蟲(chóng)外骨骼中以及幼蟲(chóng)頭殼中。β-幾丁質(zhì)和 γ-幾于需要柔性的部位中，比如圍食膜[26-29]。昆蟲(chóng)的蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)降解的調(diào)控[30]，因幾丁質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和植物纖維素十分相似，

河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文死亡。目前關(guān)于苯甲�；孱悮⑾x(chóng)劑的作用機(jī)理仍不清楚，苯甲�；鍖�(duì)幼蟲(chóng)有顯的殺蟲(chóng)效果，但對(duì)高齡期和成蟲(chóng)期的害蟲(chóng)毒性較小，速效性較差。
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S379.5

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本文編號(hào)：2621671