天然橡膠是重要的工業(yè)原料,主要來自橡膠樹。橡膠樹以蔗糖為原料,在特化的乳管(細(xì)胞)中合成天然橡膠,乳管蔗糖的代謝調(diào)控是影響膠乳再生和橡膠產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。乳管中的蔗糖來自橡膠樹葉片,在橡膠生產(chǎn)中已發(fā)現(xiàn)葉片物候和發(fā)育狀態(tài)直接影響膠乳產(chǎn)量,有關(guān)橡膠樹葉片中蔗糖代謝調(diào)控的研究很少。本課題利用本實(shí)驗(yàn)已克隆的橡膠樹中和中堿性轉(zhuǎn)化酶(NIN)、液泡轉(zhuǎn)化酶(VIN)、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶(CWI)、蔗糖合成酶(Sus)和磷酸蔗糖合成酶(SPS)等基因家族,系統(tǒng)分析了它們在不同發(fā)育時期葉片樣品中的表達(dá)模式,同時分析了葉片中的可溶性糖和淀粉含量,以及NIN、VIN、CWI、SPS和Sus(合成及分解方向)酶活性的變化,主要結(jié)果如下:(1)建立了用橡膠樹葉片粗酶液測定NIN、VIN、CWI、SPS和Sus等蔗糖代謝關(guān)鍵酶酶活性的方法;(2)探索了 NIN、VIN、CWI、SPS、Sus(合成和分解方向)活性的最適pH值、最適溫度、底物Km值、Vmax和酶穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)CWI可能在橡膠樹葉片的蔗糖代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用;(3)研究了利用HPLC-ELSD測定橡膠樹葉片中主要可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)含量的條件,確定...

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 天然橡膠的研究及應(yīng)用現(xiàn)狀
    1.2 橡膠樹的產(chǎn)膠細(xì)胞(乳管)及其特化細(xì)胞器
    1.3 NR的生物合成途徑
    1.4 膠乳再生
    1.5 蔗糖代謝及運(yùn)輸
        1.5.1 轉(zhuǎn)化酶
        1.5.2 蔗糖合成酶
        1.5.3 蔗糖磷酸合成酶
    1.6 可溶性糖的測定方法分類
        1.6.1 化學(xué)法
        1.6.2 氣相色譜法
        1.6.3 液相色譜法
    1.7 研究目的與意義
    1.8 本研究的技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 材料與試劑
        2.1.1 熱研7-33-97簡介
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.3 質(zhì)粒及菌種
        2.1.4 試劑
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 橡膠樹葉片蔗糖代謝相關(guān)酶的活性測定
        2.2.1 蔗糖代謝相關(guān)酶粗酶液的提取及保存
        2.2.2 蛋白含量測定
        2.2.3 Inv及Sus分解活性的測定
        2.2.4 Sus合成活性及SPS合成活性的測定
    2.3 橡膠樹葉片可溶性糖及淀粉含量的測定
        2.3.1 葉片中可溶性糖的提取
        2.3.2 葉片中可溶性糖含量測定
        2.3.3 葉片中淀粉的提取及含量測定
    2.4 橡膠樹葉片蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因克隆、表達(dá)分析及內(nèi)參基因的篩選
        2.4.1 橡膠樹不同組織RNA的提取
        2.4.2 總RNA完整性電泳檢測
        2.4.3 總RNA樣品中的基因組DNA的消化
        2.4.4 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
        2.4.5 橡膠樹中堿性轉(zhuǎn)化酶基因(NIN)、液泡轉(zhuǎn)化酶基因(VIN)、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因(CWI)、蔗糖合成酶基因(Sus)和磷酸蔗糖合成酶基因(SPS)的克隆
        2.4.6 HbNIN、HbCWI、HbVIN、HbSS和HbSPS基因熒光定量引物的篩選
        2.4.7 內(nèi)參基因篩選
3 結(jié)果與分析
    3.1 橡膠樹葉片蔗糖代謝相關(guān)酶的酶動力學(xué)分析
        3.1.1 蔗糖代謝酶的最適pH
        3.1.2 蔗糖代謝酶的最適溫度
        3.1.3 蔗糖代謝酶的底物Km值和最大反應(yīng)速率
        3.1.4 蔗糖代謝酶的穩(wěn)定性
    3.2 蔗糖代謝關(guān)鍵酶在不同發(fā)育時期葉片中的酶活性變化
    3.3 HPLC-ELSD測可溶性糖含量的條件篩選
        3.3.1 流動相比例的優(yōu)化
        3.3.2 柱溫的優(yōu)化
        3.3.3 氮?dú)饬魉俚膬?yōu)化
        3.3.4 漂移管溫度的優(yōu)化
    3.4 可溶性糖和淀粉在不同發(fā)育時期葉片中含量變化
    3.5 橡膠樹不同組織RNA提取及檢測
    3.6 不同發(fā)育時期葉片RNA的提取及檢測
    3.7 不同發(fā)育時期葉片cDNA樣品擴(kuò)增檢測
    3.8 葉片內(nèi)參基因的篩選
    3.9 熒光定量(qPCR)引物的篩選
    3.10 蔗糖代謝關(guān)鍵酶基因在不同發(fā)育時期葉片中的表達(dá)模式分析
        3.10.1 HbNIN各基因在不同發(fā)育時期葉片的表達(dá)模式
        3.10.2 HbVIN各基因在不同發(fā)育時期葉片的表達(dá)模式
        3.10.3 HbCWI各基因在不同發(fā)育時期葉片的表達(dá)模式
        3.10.4 HbSPS各基因在不同發(fā)育時期葉片的表達(dá)模式
        3.10.5 HbSus各基因在不同發(fā)育時期葉片的表達(dá)模式
4 討論
    4.1 關(guān)于蔗糖代謝關(guān)鍵酶酶動力學(xué)相關(guān)值的測定
    4.2 蔗糖代謝關(guān)鍵酶的活性和可溶性糖含量的關(guān)系
    4.3 蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)模式的關(guān)系
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者在讀期間科研成果簡介



本文編號：3868070