松材線蟲在環(huán)境不利條件下形成dauer型幼蟲,這種dauer型幼蟲能夠感受傳媒昆蟲——松墨天牛蛹的存在,向其蛹室聚集并附著在天牛體內(nèi),當松墨天牛蛹羽化為成蟲之后,松材線蟲便借助天牛的飛行移動實現(xiàn)寄主轉(zhuǎn)移,從而引起病害的傳播和流行。目前,科學界對松材線蟲dauer型幼蟲的形成機制尚不清楚,這也為阻止松材線蟲dauer型幼蟲形成和切斷病害流行等特異性的防控技術(shù)設(shè)置了障礙。因此,本文選擇了兩個與松材線蟲dauer型幼蟲形成相關(guān)的基因akt-1和daf-8,采用實時定量PCR(q PCR)、原位雜交(in situ hybridization)和顯微注射(microinjection)等現(xiàn)代分子技術(shù),系統(tǒng)研究其時空表達特性,并采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究這兩個基因在松材線蟲dauer型幼蟲形成過程中的調(diào)控功能,以期為揭示松材線蟲Dauer型幼蟲的形成機理提供基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.q PCR分析結(jié)果顯示,akt-1和daf-8基因的表達變化具有高度的一致性,即從胚胎到L2表達量顯著增加,L2時的表達量最高,隨后逐步下降。這表明akt-1和daf-8基因可能在松材線蟲dauer形成之前...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
1 文獻綜述
    1.1 松材線蟲病及松材線蟲基礎(chǔ)生物學研究進展
    1.2 線蟲dauer型幼蟲形成機制研究進展
        1.2.1 松材線蟲dauer型幼蟲形成機制研究進展
        1.2.2 其它線蟲dauer型幼蟲形成機制研究進展
    1.3 dauer型幼蟲形成相關(guān)基因akt-1研究進展
    1.4 dauer型幼蟲形成相關(guān)基因daf-8研究進展
    1.5 研究的目的和意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 供試線蟲的培養(yǎng)與收集
        2.1.2 供試菌株與質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
        2.1.5 所用培養(yǎng)基
        2.1.6 所需溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 繁殖周期的不同發(fā)育時期的同步松材線蟲的獲得
            2.2.1.1 松材線蟲同步胚胎的獲得
            2.2.1.2 各發(fā)育時期的同步松材線蟲的獲得
        2.2.2 松材線蟲akt-1和daf-8基因的克隆
            2.2.2.1 松材線蟲總RNA的提取與檢測
            2.2.2.2 松材線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄
            2.2.2.3 PCR擴增目的基因
            2.2.2.4 目的片段回收
            2.2.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.2.6 重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌
            2.2.2.7 重組子的篩選
            2.2.2.8 質(zhì)粒提取
        2.2.3 松材線蟲akt-1和daf-8基因不同齡期實時定量PCR(qPCR)分析
            2.2.3.1 松材線蟲qPCR模板的制備
            2.2.3.2 不同齡期松材線蟲akt-1、daf-8基因的qPCR分析
        2.2.4 松材線蟲akt-1和daf-8基因原位雜交實驗（in situ hybridization）
            2.2.4.1 原位雜交探針的制備
            2.2.4.2 松材線蟲的固定
            2.2.4.3 雜交與檢測
        2.2.5 松材線蟲akt-1和daf-8基因在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達
            2.2.5.1 松材線蟲akt-1和daf-8基因啟動子表達載體構(gòu)建
            2.2.5.2 松材線蟲akt-1和daf-8基因啟動子表達載體的顯微注射
        2.2.6 松材線蟲akt-1和daf-8基因RNA干擾（RNAi）實驗
            2.2.6.1 akt-1和daf-8基因含T7啟動子干擾片段的獲得
            2.2.6.2 dsRNA的制備
            2.2.6.3 RNAi浸泡實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 松材線蟲akt-1和daf-8基因克隆
        3.1.1 松材線蟲總RNA提取
        3.1.2 PCR擴增松材線蟲akt-1和daf-8基因
        3.1.3 重組子篩選
    3.2 松材線蟲akt-1和daf-8基因的表達研究
        3.2.1 松材線蟲akt-1和daf-8基因?qū)崟r定量PCR
            3.2.1.1 松材線蟲不同齡期同步線蟲總RNA提取
            3.2.1.2 實時定量PCR引物設(shè)計
            3.2.1.3 松材線蟲akt-1和daf-8基因不同發(fā)育時期qPCR分析
        3.2.2 松材線蟲akt-1和daf-8基因In situ hybridization
            3.2.2.1 松材線蟲akt-1和daf-8基因克隆
            3.2.2.2 PCR擴增含SP6及T7啟動子的目的片段
            3.2.2.3 松材線蟲akt-1和daf-8基因原位雜交實驗
        3.2.3 松材線蟲akt-1和daf-8基因在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達
            3.2.3.1 松材線蟲akt-1和daf-8基因的轉(zhuǎn)基因表達載體構(gòu)建圖
            3.2.3.2 PCR擴增載體片段
            3.2.3.3 PCR擴增松材線蟲akt-1和daf-8基因啟動子區(qū)域
            3.2.3.4 In-fusion Cloning
            3.2.3.5 秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)基因F2代熒光觀察
    3.3 松材線蟲akt-1和daf-8基因RNA干擾實驗
        3.3.1 PCR擴增akt-1和daf-8基因含T7啟動子干擾片段
        3.3.2 RNAi浸泡實驗
            3.3.2.1 同步卵11 h、卵18 h RNAi浸泡實驗
            3.3.2.2 同步L2幼蟲RNAi浸泡實驗
4 討論
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
個人簡介
致謝



本文編號：3830985