本研究以白樺(Betula platypylla Suk.)為材料,運(yùn)用改良的SiteFinding-PCR方法克隆得到了白樺BpGT14基因ATG上游2169 bp調(diào)控序列,并對(duì)其進(jìn)行了元件分析。同時(shí)選取了其中含有啟動(dòng)子核心元件的1156 bp序列構(gòu)建了 GUS及GFP植物瞬時(shí)表達(dá)載體,利用三親雜交及農(nóng)桿菌侵染的方法對(duì)啟動(dòng)子在煙草及白樺懸浮細(xì)胞中的啟動(dòng)模式進(jìn)行了分析。利用酵母單雜交方法分別對(duì)啟動(dòng)子1156 bp片段及MYBPLANT元件進(jìn)行了互作候選蛋白的篩選,并通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子元件共轉(zhuǎn)化煙草的方法對(duì)其互作進(jìn)行了驗(yàn)證。主要研究結(jié)果如下:1、白樺BpGT14基因啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析啟動(dòng)子2169 bp序列分析結(jié)果表明,該啟動(dòng)子除含有轉(zhuǎn)錄必備的TATA box、CAAT box等元件外,還含有多種逆境及激素響應(yīng)元件,其中包括31個(gè)脫水響應(yīng)元件及23個(gè)低溫響應(yīng)元件及多個(gè)GA,ABA和生長(zhǎng)素等激素響應(yīng)元件。值得注意的是,該啟動(dòng)子含有兩個(gè)苯丙烷及木質(zhì)素生物合成途徑的MYB類轉(zhuǎn)錄因子的重要結(jié)合元件。2、白樺BpGT14基因啟動(dòng)子活性分析對(duì)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行GUS染色,結(jié)果表明該...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 糖基轉(zhuǎn)移酶簡(jiǎn)介
    1.2 糖基轉(zhuǎn)移酶功能
        1.2.1 植物防御反應(yīng)
        1.2.2 植物次生代謝產(chǎn)物修飾
        1.2.3 植物次生細(xì)胞壁合成
        1.2.4 植物激素平衡
    1.3 糖基轉(zhuǎn)移酶14研究進(jìn)展
    1.4 啟動(dòng)子研究
        1.4.1 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及功能
        1.4.2 啟動(dòng)子克隆方法
        1.4.3 啟動(dòng)子的應(yīng)用
    1.5 轉(zhuǎn)錄因子研究
        1.5.1 轉(zhuǎn)錄因子簡(jiǎn)介
        1.5.2 轉(zhuǎn)錄因子分類及功能
    1.6 轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子互作研究方法
        1.6.1 酵母單雜交(Yeast one Hybrid)
        1.6.2 免疫共沉淀(ChIP)
    1.7 研究意義
2 白樺BpGT14基因啟動(dòng)子的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 白樺基因組DNA的提取
        2.2.2 白樺BpGT14啟動(dòng)子的克隆
        2.2.3 啟動(dòng)子生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 白樺基因組DNA的提取
        2.3.2 白樺BpGT14基因啟動(dòng)子克隆
        2.3.3 白樺BpGT14基因啟動(dòng)子序列元件分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
3 啟動(dòng)子活性及非生物脅迫誘導(dǎo)響應(yīng)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
        3.2.3 BpGT14啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)活性
        3.2.4 啟動(dòng)子在白樺細(xì)胞中的表達(dá)活性
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 啟動(dòng)子pXGUS-P及pXGFP-P植物表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        3.3.2 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的鑒定
        3.3.3 非生物脅迫下啟動(dòng)子在煙草中的表達(dá)活性
        3.3.4 啟動(dòng)子在白樺細(xì)胞中的表達(dá)活性
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
4 酵母單雜交篩選啟動(dòng)子片段結(jié)合候選蛋白
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 啟動(dòng)子1156bp片段PCR擴(kuò)增
        4.2.2 誘餌載體pAbAi線性化及與啟動(dòng)子片段的連接
        4.2.3 酵母感受態(tài)的制備
        4.2.4 重組誘餌載體pAbAi轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞
        4.2.5 誘餌酵母的鑒定
        4.2.6 報(bào)告基因在誘餌酵母中本底表達(dá)水平的測(cè)定
        4.2.7 白樺文庫(kù)cDNA的合成
        4.2.8 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建及篩選
        4.2.9 陽(yáng)性克隆菌株的鑒定
        4.2.10 陽(yáng)性克隆cDNA插入片段的生物信息學(xué)分析
        4.2.11 啟動(dòng)子候選互作蛋白BpARF2基因的非生物脅迫響應(yīng)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 重組誘餌載體的構(gòu)建
        4.3.2 重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞
        4.3.3 報(bào)告基因在誘餌酵母中本底表達(dá)水平的測(cè)定
        4.3.4 白樺文庫(kù)cDNA的合成
        4.3.5 酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建及篩選
        4.3.6 陽(yáng)性克隆cDNA插入片段的生物信息學(xué)分析
        4.3.7 啟動(dòng)子互作候選蛋白BpARF2基因非生物脅迫響應(yīng)
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
5 酵母單雜交篩選啟動(dòng)子MYBPLANT元件結(jié)合候選蛋白
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 MYBPLANT元件的構(gòu)建
        5.2.2 誘餌載體pAbAi線性化及與雙鏈DNA片段的連接
        5.2.3 酵母單雜交篩選MYBPLANT元件互作候選蛋白
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 MYB-pAbAi重組誘餌載體的構(gòu)建
        5.3.2 MYBPLANT元件互作候選蛋白的篩選
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
6 啟動(dòng)子MYBPLANT元件結(jié)合蛋白的鑒定
    6.1 實(shí)驗(yàn)材料
    6.2 實(shí)驗(yàn)方法
        6.2.1 候選蛋白互作強(qiáng)弱初步鑒定
        6.2.2 白樺BpAL4基因的克隆
        6.2.3 白樺BpAL4基因生物信息學(xué)分析
        6.2.4 候選蛋白互作強(qiáng)弱初步鑒定
        6.2.5 三次重復(fù)元件pCXGUS植物表達(dá)載體構(gòu)建
        6.2.6 三親雜交及農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化
        6.2.7 煙草中GUS基因表達(dá)水平鑒定
        6.2.8 非生物脅迫下白樺BpAL4基因表達(dá)水平鑒定
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 候選蛋白互作強(qiáng)弱鑒定
        6.3.2 白樺BpAL4基因的克隆
        6.3.3 白樺BpAL4基因生物信息學(xué)分析
        6.3.4 白樺BpAL4基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        6.3.5 三次重復(fù)元件pCXGUS植物表達(dá)載體構(gòu)建
        6.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共轉(zhuǎn)化分析
    6.4 討論
    6.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3826787