轉(zhuǎn)醛醇酶(Transaldolase,TAL)是磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway,PPP)的關(guān)鍵酶,在擬南芥、水稻等相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)TAL基因?qū)χ参锏木S管形成、木質(zhì)素合成以及植物抗逆具有一定的影響,但其在木本植物中的作用尚未報(bào)導(dǎo)。本文以84K楊為實(shí)驗(yàn)材料,通過PCR同源基因克隆法得到84K楊中的PagTAL1、PagTAL2基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、組織特異性分析,結(jié)果顯示PagTAL1、PagTAL2基因與毛果楊TAL基因同源性較高,其編碼的蛋白均為親水性蛋白,不含有分泌信號肽。亞細(xì)胞定位預(yù)測主要存在于葉綠體。本研究隨后構(gòu)建PagTAL-EGFP載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草,利用激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope,LSCM)進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察,結(jié)果顯示PagTAL1和PagTAL2主要定位于葉綠體。之后,對PagTAL1、PagTAL2進(jìn)行原核表達(dá)、酶活測定,結(jié)果顯示該基因編碼的蛋白具有轉(zhuǎn)醛醇酶活性。為了進(jìn)一步研究PagTAL1、PagTAL2在植株中的功能,本研究通過葉盤法轉(zhuǎn)化得到過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料。對8...

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【學(xué)位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 轉(zhuǎn)醛醇酶的發(fā)現(xiàn)
    1.2 轉(zhuǎn)醛醇酶的結(jié)構(gòu)研究
    1.3 轉(zhuǎn)醛醇酶基因的研究
    1.4 轉(zhuǎn)醛醇酶參與的代謝途徑及其作用
    1.5 植物轉(zhuǎn)醛醇酶研究進(jìn)展
        1.5.1 植物轉(zhuǎn)醛醇酶來源與進(jìn)化關(guān)系
        1.5.2 植物TAL的表達(dá)與分布
        1.5.3 植物轉(zhuǎn)醛醇酶的生理功能
            1.5.3.1 應(yīng)拉木與轉(zhuǎn)醛醇酶
            1.5.3.2 轉(zhuǎn)醛醇酶影響鹽脅迫響應(yīng)
            1.5.3.3 轉(zhuǎn)醛醇酶影響維管的發(fā)育
    1.6 本論文的研究內(nèi)容和意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 楊樹材料
        2.1.2 煙草材料
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 菌株
        2.1.5 質(zhì)粒
        2.1.6 溶液配制
            2.1.6.1 培養(yǎng)基的配制
            2.1.6.2 瓊脂糖凝膠溶液配制
            2.1.6.3 基因組DNA提取液制備
            2.1.6.4 抗生素的配制
            2.1.6.5 試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 植物總RNA提取
        2.2.2 cDNA的合成
        2.2.3 植物基因組DNA的提取
        2.2.4 質(zhì)粒小量提取
        2.2.5 普通瓊脂糖凝膠DNA回收
        2.2.6 大腸桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.7 大腸桿菌轉(zhuǎn)化與陽性克隆鑒定
        2.2.8 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備
        2.2.9 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與陽性克隆鑒定
        2.2.10 目的基因的克隆與載體構(gòu)建
            2.2.10.1 基因克隆和純化
            2.2.10.2 目的片段的擴(kuò)增和測序
            2.2.10.3 酶切、連接與轉(zhuǎn)化
            2.2.10.4 重組載體的鑒定
            2.2.10.5 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建
        2.2.11 煙草瞬時(shí)表達(dá)
        2.2.12 楊樹穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的篩選
            2.2.12.1 84K楊的葉盤法轉(zhuǎn)化體系
            2.2.12.2 84K楊的愈傷組織再生體系
        2.2.13 熒光定量PCR檢測
        2.2.14 原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.15 蛋白濃度測定
        2.2.16 考馬斯亮藍(lán)考R-250染色法測定蛋白質(zhì)含量
        2.2.17 轉(zhuǎn)醛醇酶酶活測定
        2.2.18 植物超氧化物歧化酶(SOD)測定
        2.2.19 植物過氧化物酶(POD)測定
        2.2.20 植物丙二醛(MDA)測定
        2.2.21 激光共聚焦顯微鏡觀察
        2.2.22 間苯三酚染色與觀察
3 結(jié)果與分析
    3.1 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析
        3.1.1 PagTAL基因編碼區(qū)序列(CDS)的克隆及分析
        3.1.2 84K中TAL蛋白的生物信息
        3.1.3 蛋白親水性、疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域與信號肽
        3.1.4 PagTAL與其他物種TAL的進(jìn)化分析
    3.2 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶的原核表達(dá)及蛋白活性分析
        3.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化
        3.2.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        3.2.3 原核表達(dá)蛋白酶活檢測
    3.3 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶的過表達(dá)及功能分析
        3.3.1 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 PagTAL1、PagTAL2過表達(dá)植株的獲得
        3.3.3 CRISPR/Cas9載體的轉(zhuǎn)化
        3.3.4 過表達(dá)PagTAL植株的RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測
        3.3.5 PagTAL1過表達(dá)植株的酶活檢測
    3.4 PagTAL1過表達(dá)對木質(zhì)素合成的影響
    3.5 高溫處理PagTAL1過表達(dá)植株的MDA及相關(guān)酶活性檢測
4. 討論
    4.1 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    4.2 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶基因的表達(dá)模式
    4.3 楊樹轉(zhuǎn)醛醇酶基因轉(zhuǎn)基因株系的獲得及研究
5. 結(jié)論
6. 參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡介
導(dǎo)師簡介
獲得成果目錄清單
致謝



本文編號：3787848