發(fā)布時間：2022-08-11 18:55

　　WRKY蛋白廣泛參與調(diào)控植物的生長、發(fā)育、衰老以及脅迫應(yīng)答等生物進程,是最重要的植物脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子家族之一,因此,WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能研究及其脅迫應(yīng)答機制研究意義重大。根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,選取了來自小黑楊（Populus simonii×Populusnigra）WRKY超家族Group Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞家族的20條鹽脅迫應(yīng)答PsnWRKY基因進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。結(jié)果表明,PsnWRKY70基因（Potri.016G137900）既能響應(yīng)生物脅迫又能響應(yīng)非生物脅迫。為了進一步探究小黑楊WRKY Group Ⅲ亞家族成員——PsnWRKY70基因/PsnWRKY70轉(zhuǎn)錄因子在生物與非生物脅迫應(yīng)答進程中的功能及其脅迫應(yīng)答機制,本研究開展了酵母單雜交、酵母雙雜交、遺傳轉(zhuǎn)化、抗逆性分析以及轉(zhuǎn)錄組測序等一系列的分子生物學及生理學實驗。首先,利用染色體步移法克隆了Psn WKY70基因的啟動子,對其測序并進行序列分析后發(fā)現(xiàn),PsnWRKY70基因的啟動子（轉(zhuǎn)錄起始位點上游2372bp的序列）區(qū)含有大量的脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件（例如W-box、GT1、MYBST1、M... 

【文章頁數(shù)】：163 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 前言
    1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子
    1.3 W-box元件
    1.4 作用于WRKY轉(zhuǎn)錄因子/WRKY基因的蛋白質(zhì)
    1.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子研究概況
        1.5.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生物脅迫應(yīng)答進程中的作用
        1.5.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫應(yīng)答進程中的作用
        1.5.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物的其他生物進程中的作用
    1.6 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的作用特點
    1.7 植物啟動子研究
        1.7.1 植物啟動子簡介
        1.7.2 植物啟動子類型
        1.7.3 植物啟動子研究現(xiàn)狀
    1.8 本研究的主要內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.8.1 主要內(nèi)容
        1.8.2 技術(shù)路線
2 生物及非生物脅迫條件下PsnWRKY基因的時序表達
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 生物脅迫所用菌株
        2.1.3 主要儀器設(shè)備與試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 PsnWRKY基因家族成員的鑒定及亞細胞定位預(yù)測
        2.2.2 多序列比對與進化樹的構(gòu)建
        2.2.3 生物與非生物脅迫處理
        2.2.4 RNA的提取、cDNA的合成以及qRT-PCR
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PsnWRKY基因及相應(yīng)蛋白的特征
        2.3.2 多序列比對與進化分析
        2.3.3 內(nèi)參基因的評價與選擇
        2.3.4 不同脅迫條件下20條PsnWRKY基因表達量的時序變化
    2.4 討論與小結(jié)
3 小黑楊PsnWRKY70基因啟動子功能研究及酵母單雜交
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 PsnWRKY70啟動子的克隆及轉(zhuǎn)錄起始位點的確定
        3.2.2 小黑楊cDNA文庫的構(gòu)建及質(zhì)量檢測
        3.2.3 酵母單雜交篩選Psn WRKY70基因的上游調(diào)控因子
        3.2.4 植物細胞中驗證酵母單雜交篩選結(jié)果
    3.3 討論與小結(jié)
4 酵母雙雜交篩選PsnWRKY70的互作蛋白
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 實驗方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 誘餌載體的構(gòu)建
        4.2.2 誘餌載體的自激活檢測
        4.2.3 WRKY蛋白在酵母細胞中的表達情況
        4.2.4 pGBKT7-WRKY與pGADT7-cDNA共轉(zhuǎn)化后的篩選
        4.2.5 回轉(zhuǎn)驗證結(jié)果
        4.2.6 陽性克隆所攜cDNA片段的生物信息學分析
        4.2.7 互作蛋白的GST-pull down體外驗證
    4.3 討論與小結(jié)
5 小黑楊PsnWRKY70基因的功能研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗材料
        5.1.2 實驗方法
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 PsnWRKY70序列的生物信息學分析
        5.2.2 PsnWRKY70基因在小黑楊不同組織部位的表達分析
        5.2.3 PsnWRKY70基因的克隆及植物表達載體構(gòu)建
        5.2.4 轉(zhuǎn)PsnWRKY70基因小黑楊的獲得及驗證
        5.2.5 轉(zhuǎn)基因小黑楊的抗逆性分析
        5.2.6 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因小黑楊轉(zhuǎn)錄組測序分析
    5.3 討論與小結(jié)
討論
結(jié)論
工作展望
參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文
致謝
附件



本文編號：3675204