可變剪接（alternative splicing,AS）和可變聚腺苷酸化（alternative polyadenylation,APA）,廣泛存在于真核生物基因轉(zhuǎn)錄后加工過程,對基因功能調(diào)控有重要意義。本研究將傳統(tǒng)的3’末端快速擴(kuò)增技術(shù)（3’-RACE）與高通量測序技術(shù)相結(jié)合,建立了一種可以同時鑒定基因剪接位點(diǎn)和聚腺苷酸化位點(diǎn)的方法（3’-RACE-seq）,經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、理論推導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,總結(jié)出較為嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選條件,將其用于研究楊樹14個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的可變剪接和可變聚腺苷酸化事件,并對其主基因模型和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的功能進(jìn)行了初步的研究。主要結(jié)果如下:（1）根據(jù)毛果楊全基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome P.trichocarpa v3.0提供的基因注釋信息,以楊樹14個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因作為研究對象,通過3’-RACE-seq對目標(biāo)基因的深度測序,將72個剪接位點(diǎn)（包括34個新發(fā)現(xiàn)的剪接位點(diǎn)）注釋到毛果楊14個NAC轉(zhuǎn)錄因子基因,進(jìn)而揭示各類復(fù)雜的可變剪接事件。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了3’-RACE-seq方法鑒定剪接位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。（2）利用3’-RACE-seq的測序結(jié)果用于鑒定... 

【文章來源】：南京林業(yè)大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

外顯內(nèi)含子的鑒定及其影響[10]

圖 1-8 可變聚腺苷酸化現(xiàn)象的四種類型 [32]Figure 1-8 The four different APA types.1.2.3 植物基因可變聚腺苷酸化的研究進(jìn)展目前，關(guān)于植物基因可變聚腺苷酸化現(xiàn)象的研究還處于初步階段。在植物中，僅在開花和休眠相關(guān)基因中有較為深入的研究 [33-36]。不過，得益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，在轉(zhuǎn)錄組層面關(guān)于可變聚腺苷酸化現(xiàn)象的研究已經(jīng)在擬南芥中展開。Wu 等 [37] 使用Poly(A)-tag 測序技術(shù) (polyA-tagging and sequencing, PAT-seq) 分析發(fā)現(xiàn)，70%的擬南芥基因存在多個不同的聚腺苷酸化位點(diǎn)簇 (poly(A) site clusters, PACs)，其中 17%的新發(fā)現(xiàn)聚腺苷酸化位點(diǎn)簇位于原基因注釋的編碼區(qū) (coding DNAsequences, CDSs)，內(nèi)含子，或 5′非翻譯區(qū) (5′-UTRs)。然而，雖然 Poly(A) tag 測序數(shù)據(jù)在篩選時已經(jīng)考慮到分子內(nèi)啟動擴(kuò)增假陽性的可能，并針對性地對參照序列上存在 6 個以上腺苷酸的聚腺苷酸化位點(diǎn)進(jìn)行過濾，但是仍不能徹底排除這種因?yàn)閷?shí)驗(yàn)技術(shù)而產(chǎn)生的假陽性數(shù)據(jù)存在的可能。在另一項研究的報道中，通過直接對擬南芥的 RNA 進(jìn)行測序，僅發(fā)現(xiàn) 1.16%的聚腺苷酸化位點(diǎn)位于原基因注釋的編碼區(qū)，內(nèi)含子，或 5′非翻譯區(qū)，而先前 Poly(A) tag 測序發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)則大多無法再

圖 2-1 目標(biāo)基因 3 -RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(M，DNAMarker；1，普通 PCR；2，乳液 PCR)Figure 2-1 Agarose gel electrophoresis of 12 3 -RACEs for 14 poplar NAC transcription factor genes. M, DNAladder; 1, Experiment 1; 2, Experiment 2; names of target genes are shown at the top of lanes.高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示 (表 2-2)：Experiment 1 測序 (普通 PCR, general PCR) 結(jié)果中，有 70.9%的測序數(shù)據(jù)能夠定位到楊樹參考基因組，其中 36.6%為預(yù)期獲得的目標(biāo)基因信息；Experiment 2 測序 (乳液 PCR, Emulsion PCR) 結(jié)果中，有 72.2%的測序數(shù)據(jù)能夠定位到楊樹參考基因組，其中 43.1%為預(yù)期獲得的目標(biāo)基因信息。比較兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果表明，乳液 PCR 擴(kuò)增體系比普通 PCR 體系產(chǎn)生更少的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，提高高通量測序產(chǎn)生有效數(shù)據(jù)的比例，從而對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定程度的優(yōu)化。表 2-2 高通量測序結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2-2 Statistical data of 3-RACE-seq.Experiment Total reads(Numberof singleReads mapped topoplar genomeReads mapped totarget genesRatio of readsmapped toreferenceRatio of readsmapped totarget genes


本文編號：3522765