本研究利用兼并-PCR及RACE技術(shù)克隆了興安落葉松（Larix gmelinii）的咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（命名為L(zhǎng)g COMT）,并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式進(jìn)行了分析。所克隆的Lg COMT c DNA全長(zhǎng)為1 173 bp,包含1 092 bp的開放閱讀框,編碼364個(gè)氨基酸;基因組DNA全長(zhǎng)為1 400 bp,包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,Lg COMT與日本落葉松、挪威云杉和北美云杉等裸子植物COMT的親緣關(guān)系較近。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示,Lg COMT基因主要在興安落葉松的幼莖中表達(dá),與其功能相一致。本研究為進(jìn)一步分析興安落葉松咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的功能,表達(dá)特性及其在木質(zhì)素單體生物合成中的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：分子植物育種. 2016,14(07)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

兼并PCR及RACE-PCR產(chǎn)物凝膠電泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR產(chǎn)物;3:3'RACE-PCR產(chǎn)

圖1兼并PCR及RACE-PCR產(chǎn)物凝膠電泳注:M:100bpmarker;1,2:兼并PCR產(chǎn)物;3:3'RACE-PCR產(chǎn)物;4:5'RACE-PCR產(chǎn)物Figure1ProductsofdegeneratePCRandRACE-PCRNote:M:100bpmarker;1,2:Productofdegennerate-PCR;3:Productof3'RACE-PCR;4:Productof5'RACE-PCR圖2擴(kuò)增LgCOMTcDNA和基因組DNA序列的PCR產(chǎn)物電泳注:M:200bpmarker;1:LgCOMTcDNA擴(kuò)增產(chǎn)物;2:LgCOMT基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物Figure2Productsforamplificationoffull-lengthcDNAandge-nomicDNAofLgCOMTNote:M:200bpmarker;1:ProductforamplificationofLgCOMTcDNA;2:ProductforamplificationofgenomicDNAofLgCOMT多而復(fù)雜的生物學(xué)功能。木質(zhì)素單體的合成由苯丙氨酸(或酪氨酸)脫氧形成肉桂酸起始，經(jīng)過羥基化、甲基化及還原等一系列反應(yīng)生成三種木質(zhì)素單體(劉媛等,2007)。在木質(zhì)素單體的生物合成過程中需要3'和5'位置的兩步甲基化反應(yīng)，咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeicacid-3-O-methltransferase,COMT)和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeovlCoA-3-O-methyltransferase,CCoAOM-T)是兩個(gè)不同底物水平上的甲基化酶，它們催化咖啡酸、5-羥基松柏醇和5-羥基松柏醛分別生成阿魏酸、芥子醇和芥子醛，進(jìn)而生成S型木質(zhì)素(魏建華和宋艷茹,2001)。COMT作為木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，除了參與S型木質(zhì)素單體的合成外還與G型木質(zhì)素轉(zhuǎn)化S型木質(zhì)素的反應(yīng)途徑密切相關(guān)。紫丁香基木質(zhì)素單體多一個(gè)甲氧基基團(tuán)與愈創(chuàng)木基木質(zhì)素相比，從而多聚體中含有少量的C-C連接，由于C-C連接可使木質(zhì)素結(jié)構(gòu)致密(李潞濱等,2007)。前人通過遺傳轉(zhuǎn)化研究證實(shí)，COMT基因不同程度地參與木質(zhì)素生物合成的調(diào)控(Trabuccoetal.,2013;Wengetal.,2011)。抑制COMT基因表達(dá)的二穗短柄草中，總木

分子植物育種MolecularPlantBreeding圖3LgCOMT基因結(jié)構(gòu)示意Figure3TheschematicdiagramofLgCOMTgenestructure圖4LgCOMT的核苷酸及推測(cè)的氨基酸序列Figure4NucleotideanddeducedaminoacidsequencesofLgCOMT1092bp的開放閱讀框(ORF)，編碼364個(gè)氨基酸。利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析軟件ProtParam計(jì)算其蛋白分子量和理論等電點(diǎn)，分別為40.18kD和5.63�；蚪MDNA全長(zhǎng)為1400bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，三個(gè)外顯子長(zhǎng)分別為759bp、65bp和349bp；兩個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)分別為91bp和136bp(圖3)。LgCOMT基因編碼的蛋白具有甲基轉(zhuǎn)移酶典型結(jié)構(gòu)(圖4)，其包含S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-ad-enosyl-L-methionine,SAM)結(jié)合位點(diǎn)(LVDVGGGV)。1.2.2LgCOMT基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析利用MEGA5.0對(duì)LgCOMT基因編碼的氨基酸序列與北美云杉、銀杏、葡萄、擬南芥等15種植物的COMT氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖5)，興安落葉松LgCOMT與日本落葉松(L.kaempferi)、挪威云杉(P.abies)、銀杏(G.biloba)和北美云杉(P.sitc-hensis)等裸子植物COMT聚為一類，其中與日本落葉松COMT的遺傳距離最近；與葡萄(V.vinifera)、丹參(S.miltiorrhiza)、蘋果(M.domestica)、擬南芥(A.thaliana)和蒺藜狀苜蓿(M.truncatula)等被子植物C-OMT的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。1.3興安落葉松LgCOMT基因的組織特異性表達(dá)利用RT-PCR進(jìn)行LgCOMT表達(dá)模式檢測(cè)結(jié)果顯示，LgCOMT在興安落葉松幼苗的根、莖和葉組織中均有表達(dá)，幼莖和針葉中的表達(dá)量相對(duì)較高，根中的表達(dá)量最少(圖6)。2討論植物木質(zhì)素合成需要多種酶的參與，其中咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)作為重要的甲基轉(zhuǎn)移酶在木質(zhì)素合成中充當(dāng)著重要的角色。COMT是一個(gè)依賴S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)作為甲基?

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]丹參咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（SmCOMT1）的克隆及其分析[J]. 宋銀,王東浩,吳錦斌,周露,王國(guó)棟,王喆之.  植物研究. 2012(04)
[2]可再生生物質(zhì)資源——木質(zhì)素的研究[J]. 李忠正.  南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(01)
[3]棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的組織特異性表達(dá)分析[J]. 呂萌,倪志勇,王娟,李波,羅淑萍,范玲.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2010(04)
[4]棉花咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及特征分析[J]. 倪志勇,呂萌,李波,王娟,白巖,范玲.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(06)
[5]木質(zhì)素單體生物合成途徑研究進(jìn)展[J]. 劉媛,黃真池,曾富華,陳信波.  湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào). 2007(06)
[6]木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶基因的研究進(jìn)展[J]. 李潞濱,劉蕾,何聰芬,董銀卯,彭鎮(zhèn)華.  分子植物育種. 2007(S1)
[7]綠竹咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（COMT）的克隆及相關(guān)分析[J]. 李雪平,高志民,彭鎮(zhèn)華,岳永德,高健,蔡春菊,牟少華.  林業(yè)科學(xué)研究. 2007(05)
[8]木質(zhì)素合成酶咖啡酸3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）的遺傳調(diào)控研究[J]. 郭昭,趙一玲,劉景利,薛永常.  分子植物育種. 2006(S2)
[9]木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 魏建華,宋艷茹.  植物學(xué)報(bào). 2001(08)
[10]毛白楊COMT基因cDNA的克隆、序列與特異性表達(dá)分析（英文）[J]. 魏建華,趙華燕,盧善發(fā),王臺(tái),馬慶虎,宋艷茹.  植物學(xué)報(bào). 2001(03)

碩士論文
[1]東北白樺COMT1和CESA4基因克隆及反義COMT1遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 呂夢(mèng)燕.東北林業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3288234