雌配子體是胚珠的核心結(jié)構(gòu),雌配子體游離核分裂期是胚珠發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵時(shí)期。核分裂的失敗將阻礙雌配子體的成熟和卵細(xì)胞的產(chǎn)生,可導(dǎo)致植株的雌性不育現(xiàn)象。所以,對(duì)該時(shí)期胚珠發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前,調(diào)控胚珠發(fā)育的分子機(jī)制已見(jiàn)報(bào)道,但主要圍繞被子植物展開(kāi),對(duì)裸子植物的相關(guān)研究較少。而裸子植物的胚珠發(fā)育與被子植物不同,特別是木本植物,其差異更加明顯。本論文以遼寧興城油松種子園中28號(hào)雌性不育系和可育系油松胚珠為材料,在前人研究的基礎(chǔ)上采用抑制性消減雜交（supression subtractive hybridization,SSH）文庫(kù)建立技術(shù),和轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序（RNA-seq）技術(shù),輔以生物信息學(xué)等研究手段,對(duì)油松可育系（fertile line,FL）和不育系（sterile line,SL）在雌配子體游離核有絲分裂不同時(shí)期的胚珠差異表達(dá)基因進(jìn)行研究,篩選功能性候選基因,以揭示雌配子體游離核有絲分裂的分子調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)建立油松可育系與不育系胚珠正向與反向cDNA消減文庫(kù),分析了游離核有絲分裂時(shí)期雌性可育系與不育系的差異表達(dá)基因。從兩... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖３－〗油松胚珠總ＲＮＡ瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，ＦＬ：可育系；ＳＬ：不育系

??圖３－２油松胚珠ｃＤＮＡ擴(kuò)增結(jié)果。ＦＬ：可育系；ＳＬ：不育系??Ｆｉｇ．?３－２?ｃＤＮＡ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｐｉｎｕｓ?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ?ｏｖｕｌｅｓ??３．１．３ＲｓａＩ酶切處理??經(jīng)酶切后，分別將可育系與不育系油松胚珠ｃＤＮＡ酶切前和酶切后的樣品通過(guò)??瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ｃＤＮＡ條帶呈彌散狀，經(jīng)酶切的ｃＤＮＡ在長(zhǎng)度上較未經(jīng)酶切??ｃＤＮＡ樣品更小。??３．１．４消減雜交效率檢測(cè)??消減雜交效率直接影響消減文庫(kù)的質(zhì)量，較高的消減雜交效率會(huì)增加差異表達(dá)??轉(zhuǎn)錄本的含量，降低篩選差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的難度。從圖３－３中可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄??本的含量在消減后有明顯的下降。在消減后ｃＤＮＡ擴(kuò)增中，７Ｉ／５ｔ／Ｚ／７Ｖ?jǐn)U增產(chǎn)物在??２３個(gè)循環(huán)時(shí)被觀察到；而在未消減ｃＤＮＡ中，擴(kuò)增產(chǎn)物在１８?jìng)�(gè)循環(huán)時(shí)己被觀察??至ＩＪ。結(jié)果表明基因的含量在消減后被降低了高達(dá)２５倍，說(shuō)明消減雜交過(guò)??程成功完成

過(guò)藍(lán)白斑篩選，獲得大量陽(yáng)性克隆，比率約為７０％。隨機(jī)挑取菌落進(jìn)行克隆，數(shù)量??共計(jì)７５６個(gè)，然后進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，檢測(cè)插入片段，通過(guò)菌液ＰＣＲ進(jìn)行測(cè)序前的預(yù)??檢測(cè)，篩除具有多個(gè)擴(kuò)增子的菌液樣品，或沒(méi)有擴(kuò)增子的菌液樣品。圖３－４中所示??為其中的１０個(gè)檢測(cè)結(jié)果，條帶多處于１５０－８００范圍內(nèi)。經(jīng)ＰＣＲ篩選，１８?jìng)�(gè)克隆??（２．４％）由于出現(xiàn)多個(gè)插入片段被排除，剩余的轉(zhuǎn)錄本被送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。??２〇〇〇ｂｐ－＾？：Ｖ?．?－?－?Ｙ??ｉ?ｏｏｏｂｐ—？??７５０ｂｐ—？?．??ｓｏｏｂｐ—國(guó)??２Ｓ０ｂｐ?？?■??１?—Ｐ—丄？；蓉遽??圖３－４菌液ＰＣＲ檢測(cè)插入片段??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｉｎｓｅｒｔｅｄ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ?ｂｙ?ｆｕｎｇｕｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ＰＣＲ??３．２．２陽(yáng)性克隆ＥＳＴ片段測(cè)序??將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液送至上海生工公司進(jìn)行ｓａｎｇｅｒ測(cè)序，在去除低質(zhì)量序列數(shù)??據(jù)、載體和接頭序列后，共計(jì)得到７０１條高質(zhì)量表達(dá)序列標(biāo)簽（Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??Ｔａｇｓ，?ＥＳＴｓ），長(zhǎng)度由?１０５?ｂｐ?到?７６３?ｂｐ。??３．２．３生物信息學(xué)分析??ｃＤＮＡ消減文庫(kù)包含上調(diào)和下調(diào)（可育系ｖｓ不育系）表達(dá)的基因。將所得到??的?ＥＳＴ?對(duì)?ＥＢＩ?ＵｎｉＰｒｏｔ?Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ?數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行?ＢＬＡＳＴＸ?檢索，在?７０１?條?ＥＳＴ??中，其中４３０條（６１．３％）序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的條目具有高度相似性（Ｅ值低于１０＿??４）

【參考文獻(xiàn)】：
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