木質(zhì)素作為木材的主要組成成分,通常是由三種單體聚合而成,在其生物合成過(guò)程中,共有10個(gè)酶家族參與負(fù)責(zé)將苯丙胺酸轉(zhuǎn)化為單體木質(zhì)素,其中C3H是在對(duì)-香豆酰釀?shì)o酶A(p-coumaroyl CoA)到咖啡酰輔酶A(caffeoyl CoA)的經(jīng)基化過(guò)程和G/S單體形成中的關(guān)鍵控制酶類(lèi),探究PagC3H究基因的功能,對(duì)于林木選育和材性改良具有重要意義。本文主要通過(guò)從84K楊中克隆獲得了PagC33基因,并進(jìn)行了基因組織特異性表達(dá)分析和啟動(dòng)子功能探究,從而對(duì)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證,通過(guò)過(guò)量表達(dá)和RNAi抑制表達(dá)并遺傳轉(zhuǎn)化84K楊對(duì)PagC3H3基因進(jìn)行了生物學(xué)功能的初步探究,結(jié)果如下:(1)84K楊PagC3H3基因CDS全長(zhǎng)為1527 bp,編碼一個(gè)由508個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)序列;組織特異性表達(dá)分析顯示,該基因在84K楊不同組織中表達(dá)存在差異,在根、中部莖節(jié)和基部莖節(jié)等木質(zhì)化程度高的組織中表達(dá)量較高,在其他部位表達(dá)量較低;克隆得到了 2035 bp長(zhǎng)的PagC3H3啟動(dòng)子序列,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化擬南芥和遺傳轉(zhuǎn)化84K楊,GUS染色結(jié)果均顯示在木質(zhì)化程度高的部位著色較深,推測(cè)84K楊PaagC3H3啟動(dòng)子調(diào)控PagC3HP基因在木質(zhì)化程度高的組織中強(qiáng)烈表達(dá)。(2)對(duì)PagC3H3蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示:PagC3H3-GFP的綠色熒光信號(hào)僅在細(xì)胞質(zhì)中顯示,由此推測(cè)PagC3H3是一個(gè)定位于細(xì)胞質(zhì)中的功能蛋白。(3)過(guò)表達(dá)株系(OE-PagC3H3)具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),株高明顯高于野生型,而RNAi抑制表達(dá)株系(RNAi-PagC3H3)生長(zhǎng)緩慢,株高低于野生型;過(guò)表達(dá)株系葉片比同一位置野生型的葉片大,RNAi抑制表達(dá)株系則比野生型葉片小,且同一株系第七片葉片均比第六片葉片大。(4)過(guò)表達(dá)株系木質(zhì)部層數(shù)都要比野生型多,而RNAi抑制表達(dá)株系木質(zhì)部層數(shù)則要比野生型少;同一植株由上而下的第八、第九、第十莖段木質(zhì)部層數(shù)都逐漸增加。(5)對(duì)不同轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行木質(zhì)部木質(zhì)素、纖維素、半纖維素三種成分含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),PagC3H3基因過(guò)表達(dá)顯著提高了木質(zhì)素含量,抑制表達(dá)顯著降低了木質(zhì)素含量,而纖維素和半纖維素的含量變化差異不顯著,推測(cè)PagC3H3基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用。(6)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行抗蟲(chóng)性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)在取食時(shí)傾向選擇木質(zhì)素含量較少,木質(zhì)化程度較低的抑制表達(dá)株系葉片,而對(duì)過(guò)表達(dá)株系葉片取食較少,進(jìn)一步證實(shí)了PagC3H3基因在植物體內(nèi)調(diào)控木質(zhì)素的合成中發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S792.11
【部分圖文】：

?７０??Ｐｏｓｉｔｉｏｎ??圖２－４?８４Ｋ楊ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)??Ｆｉｇ．?２＞４?Ｓｉｇｎａｌ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＰａｇＣ３Ｈ３?Ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?Ｐｏｐｕｌｕｓ?ａｌｂａ?ｘ?Ｐ．?ｇｌａｎｄｕｌｏｓａ??２．３．２＿３?８４Ｋ楊ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析??利用?ＮＣＢＩ?中的在線(xiàn)工具?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?Ｄｏｍａｉｎ?Ｓｅａｒｃｈ?Ｓｅｒｖｉｃｅ?（ＣＤ?Ｓｅａｒｃｈ）對(duì)??ＰａｇＣ３Ｈ３蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示在第１？５０２個(gè)氨基酸區(qū)間內(nèi)包含有??ｐ４５０?ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ結(jié)構(gòu)域

３．２．２?ｐＢＩ１２１－／＾Ｃ朋ｐｒｏ：．?ＧｒＳ?載建??３．２．２．１?ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－ＰａｇＣｍＪ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ?和?ｐＢＩ１２１?載體的雙酶切??植物表達(dá)載體ＰＢＩ１２１含有ＧＵＳ融合蛋白系統(tǒng)，參照載體圖譜（圖３－１Ａ），將??啟動(dòng)子構(gòu)建到ｐＢＩ１２１載體上，構(gòu)建植物表達(dá)載體ｐＢＩ１２１－??Ｐ嘆Ｃ３Ｈ５ｐｒｏ：．ＧＣ／Ｓ。參考第二章?２．２．３．３?的方法提取?ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－Ｐ呢ＣＪ／／Ｊ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ?和??ｐＢＩ１２１兩種載體的質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)量和濃度后，根據(jù)載體構(gòu)建示意圖（圖３－１Ｂ），利用??所ｍ／?ＩＩＩ和Ｉ這兩種限制性?xún)?nèi)切酶分別對(duì)ｐＥＡＳＹ－Ｔｌ－Ｐｆｌ＾ＣＪ／／Ｊ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ和ｐＢＩ１２１??質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系見(jiàn)表３－２，酶切反應(yīng)結(jié)束后將酶切產(chǎn)物全部進(jìn)行１％瓊脂糖凝??膠電泳檢測(cè)，利用Ｂｉｏｅｒ公司的Ｂｉｏｓｐｉｎ膠回收試劑盒分別回收ｐＥＡＳＹ－??ｐｒｏｍｏｔｅｒ載體酶切后的耙片段ＰａｇＯ／／ｉ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ和ｐＢＩ１２１載體大片段，操作方法同??第二章?２．２．３．１。??－１８－??

將兩周齡的擬南芥幼苗浸泡在農(nóng)桿菌（ｐＢＩＵｌ－ＰａｇＣＪ／＾ｐｒｏ．ｖＧｔ／Ｓ）菌液中，進(jìn)行??瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，之后將共培養(yǎng)的擬南芥經(jīng)ＧＵＳ染色，固定脫色處理后，在實(shí)體顯微鏡下觀??察ＧＵＳ染色情況，結(jié)果顯示，在擬南芥下胚軸和根中著色較深（圖３－５），推測(cè)８４Ｋ??楊ＰＭＣ５／／Ｊ啟動(dòng)子調(diào)控下游基因在木質(zhì)化程度高的組織中表達(dá)。??ｍ??圖３－５尸ａｇＣ３出啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ＧＵＳ在擬南芥中的ＧＵＳ染色??Ｆｉｇ．?３－５?ＧＵＳ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｄｒｉｖｅｎ?ｂｙ?ｔｈｅ?ＰａｇＣ３Ｈ３?ｐｒｏｍｏｔｅｒ?ｍ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ??３．３．４?ｐＢｎ２１－／＾Ｃｍ？ｐｒｏ：：Ｇ仍載體遺傳轉(zhuǎn)化?８４Ｋ?楊??將農(nóng)桿菌（ｐＢＩ１２１－ＰｏｇＣＪ／／＿５ｐｒｏ．＿：ＧａＳ）搖菌活化，利用葉盤(pán)法對(duì)８４Ｋ楊進(jìn)行遺傳??轉(zhuǎn)化，將共培養(yǎng)２ｄ后的葉片放入含有１０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選，大??約２０?ｄ后，葉片愈傷處分化出不定芽，切取不定芽放入含有４０?ｍｇ／Ｌ?Ｋａｎ的選擇培養(yǎng)基??中繼續(xù)進(jìn)行篩選（圖３－６Ａ）
【參考文獻(xiàn)】

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1 張諾瑤;;木質(zhì)素的應(yīng)用研究現(xiàn)狀及展望[J];化學(xué)工程師;2012年02期

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本文編號(hào)：2861155