楊樹易繁殖、生長迅速,是世界上廣泛栽培的重要用材樹種。楊樹全基因組已被測序,成為林木科學(xué)研究的模式樹種。林木地上部分的生長主要來自于莖尖分生組織(shoot apical meristems,SAM)的發(fā)育分化。莖尖分生組織是位于植物頂端具有持續(xù)分化能力的組織,通過細(xì)胞分裂、分化產(chǎn)生莖、葉和花等器官。植物莖尖分生組織的分化進(jìn)程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,目前關(guān)于木本植物的SAM研究主要集中在激素和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控,而有關(guān)SAM轉(zhuǎn)錄后水平研究尚未見報道。miRNAs是一類重要的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子,其參與SAM生長發(fā)育的相關(guān)調(diào)控機制卻不清楚。本研究中,以毛白楊(Populus tometosa)不同生長階段的莖尖分生組織為主要研究對象,以莖尖分化形成的葉片為對照,采用高通量測序方法構(gòu)建莖尖分生組織和葉片的小RNA數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行比較研究分析。此外,除莖尖分生組織外,種子萌發(fā)是林木樹種生長發(fā)育以及有性繁殖的重要基礎(chǔ),然而不同外界因素對楊樹種子萌發(fā)影響的研究報道卻較少。因此,本論文也研究了不同外界環(huán)境因素對楊樹種子萌發(fā)的影響。主要結(jié)果如下:(1)在莖尖和葉片中分別獲得11,321,446和11,926,435個clean reads,文庫中的小RNA序列長度主要分布18nt到30nt之間,且主峰值在21nt處,符合被子植物典型miRNAs長度分布。(2)比對miRBase數(shù)據(jù)庫分別獲得莖尖和葉片中已知miRNAs共計231和256種。同時,在楊樹莖尖和葉片中,分別預(yù)測到185和181個新miRNAs。(3)根據(jù)楊樹全基因組序列、應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站程序psRobot和TargetFinder進(jìn)行靶基因預(yù)測。結(jié)果表明,已知miRNAs預(yù)測到1796個靶基因,新miRNAs預(yù)測到1507個靶基因。這些靶基因的功能均主要集中在蛋白結(jié)合、細(xì)胞進(jìn)程和催化活性等通路上。(4)對于差異表達(dá)miRNAs的分析,與葉片比較,已知miRNAs中莖尖上調(diào)的有14個,下調(diào)的有54個;新miRNAs中莖尖上調(diào)的有27個,下調(diào)的有30個。進(jìn)一步對差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行功能注釋,結(jié)果表明已知miRNAs中莖尖表達(dá)量上調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在光敏色素互作、葉片著色和葉形態(tài)建成等途徑;莖尖表達(dá)量下調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在細(xì)胞分裂分化、生長素響應(yīng)和細(xì)胞分裂素響應(yīng)等與激素響應(yīng)有關(guān)的途徑。同時,新miRNAs中莖尖表達(dá)量上調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在捕光葉綠素合成和葉綠素酸酯a加氧酶等與光合作用相關(guān)的的途徑;莖尖表達(dá)量下調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在RNA聚合酶等途徑。這些結(jié)果表明,莖尖在發(fā)育過程中,可通過激素相關(guān)miRNAs負(fù)向調(diào)控其靶基因,進(jìn)而影響植株的生長發(fā)育。(5)ptc-miR166 家族成員中 ptc-miR166n、ptc-miR166o 和 ptc-miR166q 在莖尖分生組織中均顯著下調(diào),并靶向多個與細(xì)胞分裂分化相關(guān)的Ⅲ型H(class ⅢHOMEODOMAIN-LEUCINEZIPPER)轉(zhuǎn)錄因子家族成員。進(jìn)一步進(jìn)行q RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn),ptc-miR166及其靶基因HD-ZIP在分化過程中,表達(dá)量呈現(xiàn)出相反趨勢,表明HD-ZIP可能是ptc-miR166的目標(biāo)靶基因,ptc-miR166通過負(fù)反饋調(diào)控HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子在莖尖分生組織中起到重要調(diào)控作用。(6)ptc-miR393 家族成員中 ptc-miR393a、ptc-miR393b 和 ptc-miR393c 在莖尖中均顯著下調(diào),并靶向多個與生長素響應(yīng)相關(guān)的TRI1(transportinhbitorresponse1)轉(zhuǎn)錄因子。熒光定量結(jié)果表明,ptc-miR393及其靶基因TRI1在發(fā)育過程中,表達(dá)量呈現(xiàn)出相反趨勢,說明TRI1可能是ptc-miR393的目標(biāo)靶基因,ptc-miR393通過負(fù)反饋調(diào)控TRI1轉(zhuǎn)錄因子在生長素響應(yīng)過程中起到關(guān)鍵作用。(7)以毛白楊種子為實驗材料,研究不同溫度、鹽分、pH值和光照強度對毛白楊種子萌發(fā)的影響。毛白楊種子在晝夜溫度為23℃/18℃時,種子發(fā)芽率最高。同時,種子發(fā)芽能力明顯受鹽脅迫影響,發(fā)芽率隨鹽濃度的增加而下降。此外,酸堿度也可影響種子萌發(fā),種子在中性環(huán)境下萌發(fā)率最高。在一定光照強度下,種子的發(fā)芽率會隨著光照強度的增加而增加,表明光照促進(jìn)種子的萌發(fā)。本研究以毛白楊莖尖分生組織和葉片為材料,建立了兩個小RNA文庫,篩選出差異表達(dá)的miRNAs,并且結(jié)合預(yù)測獲得的靶基因及靶基因功能注釋,運用熒光定量PCR技術(shù),研究了 miRNAs與預(yù)測靶基因的表達(dá)關(guān)系及其在毛白楊莖尖分化與發(fā)育過程中的功能。同時,使用不同外界環(huán)境因素對毛白楊種子進(jìn)行處理,研究了種子萌發(fā)的環(huán)境影響因素。研究結(jié)果有助于揭示楊樹莖尖分生組織分裂、分生的miRNAs調(diào)控機制,以及適宜楊樹種子萌發(fā)的環(huán)境因子,為毛白楊莖尖生長分化的基礎(chǔ)研究和播種應(yīng)用技術(shù)提供理論依據(jù)和實踐參考。
【學(xué)位單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S792.11
【部分圖文】：

茄莖尖環(huán)境掃描電鏡圖：ａ．莖尖細(xì)胞組織分區(qū)圖；ｂ．生長素（ＡＵＸＩＮ）空間梯度分布圖；ｃ．細(xì)胞分裂素逡逑（ＣＴＫ）空間梯度分布圖；Ｐ１．新萌發(fā)葉片區(qū)域；Ｐ２．其次萌發(fā)葉片區(qū)域；Ｐ０．即將形成新葉原基區(qū)域．逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｘｉｎ邋ａｎｄ邋ｃ＾ｏｋｉｎｉｎ邋（ＣＴＫ）邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｈｏｏｔ邋ｔｉｐ邋（ｍｏｄｉｆｉｅｄ邋ｆｒｏｍ邋Ｒｅｆ．邋［３５］）．逡逑ｈｅ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋（ＳＥＭ）邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ａ邋ｔｏｍａｔｏ邋ＳＡＭ：邋ａ．邋Ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ＳＡＭ；邋ｂ．邋Ｔｈｅ逡逑ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｕｘｉｎ；邋ｃ．邋Ｔｈｅ邋ｓｐａｔｉａｌ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ邋（ＣＴＫ）；邋Ｐｌ．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑ｕｎｇｅｓｔ邋ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ邋ｌｅａｆ；邋Ｐ２．邋Ｔｈｅ邋ｎｅｘｔ邋ｏｌｄｅｓｔ邋ｌｅａｆ；邋ＰＯ．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ邋ｔｏ邋ｐｒｏｄｕｃｅ邋ｔｈｅ邋ｎｅｘｔ邋ｌｅａｆ邋ｐｒｉｍｏｒｄｉｕｍ．逡逑４莖尖分生組織分化的分子調(diào)控機制逡逑４．１莖尖分生組織分化活動的轉(zhuǎn)錄調(diào)控逡逑轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，可根據(jù)周邊環(huán)境或自身發(fā)育需要逡逑過轉(zhuǎn)錄因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｆａｃｔｏｒｓ，邋ＴＦｓ）在特定條件下對基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響逡逑尖分生組織的分化活動。轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因５＇端上游特異性結(jié)合，進(jìn)而促使目的逡逑因以特定的強度在特定的時間和空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。有關(guān)

陸維超：楊樹莖尖�。遥危两M學(xué)和種子萌發(fā)技術(shù)研究第二章材料與方法逡逑材料逡逑材料逡逑料取自揚州大學(xué)校園內(nèi)（３２．３９°邋Ｎ，邋１１９．４２°邋Ｅ）的毛白楊（Ｐｏｐｗ／ｉｗｔｏｗｅｒｔｔｏｒａ２０年，栽培管理一致，生長發(fā)育正常，具有代表性。為驗證發(fā)育周期中不的分子變化，我們采集三個發(fā)育階段的實驗材料。恢復(fù)活躍期的材料采集尖周圍無明顯葉片附著；活躍初期的材料采集于當(dāng)年四月，莖尖周邊有數(shù)片；活躍穩(wěn)定期材料采集于當(dāng)年六月，莖尖周圍生長著大量深綠色成熟葉片，樣品采集洗凈后即迅速使用－８０°Ｃ液氮進(jìn)行超低溫冷卻保存用于后續(xù)實驗。階段的樣品均用于進(jìn)行組織塊包埋和熒光定量實驗，同時包含大量生理生期樣品提�。遥危劣糜诟咄繙y序。逡逑

３．１莖尖分生組織和葉片的形態(tài)學(xué)和解剖結(jié)構(gòu)觀察逡逑毛白楊莖尖分生組織和葉片無論是外部形態(tài)還是組織結(jié)構(gòu)上均存在著明顯季異。通過數(shù)碼相機拍攝毛白楊莖尖分生組織和葉片可以發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)活躍期，莖尖織位于莖干頂端，周邊無葉片附著（圖５－ａ）。而活躍初期和穩(wěn)定活躍期，莖尖分周邊有葉片生成，葉片位于莖尖下端，卵形或三角狀卵形，上表皮暗綠色有金屬光表皮光滑，具深波狀齒牙緣，接近莖尖的葉片更為幼嫩。且活躍穩(wěn)定期相對于活躍葉片，葉色更深，體積更大，更為成熟（圖５－ｂ，ｃ）。進(jìn)一步對不同時期莖尖分生葉片進(jìn)行組織塊包埋處理，并采用樹脂切片技術(shù)，光學(xué)顯微鏡下觀察兩者在細(xì)胞水差異�；謴�(fù)活躍期的莖尖分生組織中的并無明顯干細(xì)胞群的出現(xiàn)（圖５－ｄ）。而在期的莖尖分生組織中則可發(fā)現(xiàn)明顯的原體－原套模型，頂部有數(shù)層細(xì)胞明顯呈帶狀胞體積較小，排布緊密。遠(yuǎn)離頂部的細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，且無帶狀排列現(xiàn)象出現(xiàn)，現(xiàn)象在前人的研宄中表明與干細(xì)胞群的形成有關(guān)［９７］。這些現(xiàn)象在活躍穩(wěn)定期并無現(xiàn)，且葉片已可從表皮層分化出來（圖５－ｅ，ｆ）。此外，活躍穩(wěn)定期相對于活躍初葉片排列更為緊密，細(xì)胞層數(shù)更多（圖５－ｇ，ｈ）。逡逑

本文編號：2818603