【摘要】：低溫會對植物生長產(chǎn)生不利影響,已有研究表明,ICE1基因在低溫條件下可以特異性結(jié)合CBF3啟動子中的MYC順式作用元件,進而誘導(dǎo)CBF3調(diào)控的一系列下游基因的表達,在植物低溫脅迫應(yīng)答中具有重要的功能。本研究以小黑楊(Populus simonii×Pnigra)為研究對象,克隆PsnICE1基因及其啟動子序列。序列比對結(jié)果顯示,小黑楊PsnICE1保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種同類的ICE1蛋白序列有較高的一致性,小黑楊PsnICE 1蛋白與其他物種ICE1蛋白序列相比,bHLH功能域以及C端高度保守,但N端序列保守性較低。系統(tǒng)發(fā)育樹研究發(fā)現(xiàn),小黑楊PsnICE1基因與蓖麻、甜楊親緣關(guān)系較近�？寺～@得PsnICE1基因上游1247 bp啟動子序列,通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),該段序列中含有典型的真核生物核心啟動子區(qū)域,除了包含TATA-box、CAAT-box等基本順式作用元件外,還存在其它可能與逆境脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的作用元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box 和MYCCONSENSUSATHSE等,這些元件有些與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān),這表明PsnICE1基因可能與逆境脅迫相關(guān),在小黑楊抵御逆境脅迫的生理過程中具有重要功能。構(gòu)建pROK2-PsnICE1-GFP載體,利用基因槍技術(shù),將PsnICE1和GFP融合表達載體通過瞬時轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細胞,進行亞細胞定位研究,結(jié)果顯示,PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子定位在細胞核中。利用qRT-PCR研究小黑楊PsnICE1基因在低溫脅迫下的表達模式,結(jié)果顯示,PsnICE1基因在根、莖、葉中均有表達,其表達量從脅迫1.5到72 h之間一直呈上調(diào)趨勢,且在72 h時達到峰值,表明PsnICE1基因能夠被低溫脅迫誘導(dǎo)表達。PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性,轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在N端第66-137氨基酸內(nèi)。為了分析PsnICE1基因是否具有抗寒功能,構(gòu)建了PsnICE1基因過表達載體pROK2-PsnICE1及抑制表達載體pFGC5941-PsnICE1,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過表達與抑制表達小黑楊植株。分別利用組織化學(xué)染色分析了低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小黑楊的H202、02-含量及細胞膜透性,并進一步測定了抗逆相關(guān)生理指標,包括MDA、H202含量、相對電導(dǎo)率、脯氨酸含量等的變化情況。結(jié)果顯示,過表達小黑楊的MDA、H202含量和相對電導(dǎo)率最低,細胞膜完整性最好,而PsnICE1抑制表達植株的MDA、H2O2和02-含量及相對電導(dǎo)率最高,細胞膜損傷最嚴重。此外,PsnICE1基因能夠通過調(diào)控SOD和POD基因的表達,來提高SOD和POD的活性,從而降低ROS在低溫脅迫下的積累。以上結(jié)果表明PsnICE1基因過表達能夠提高轉(zhuǎn)基因小黑楊的抗低溫能力。利用RNA-seq技術(shù)分析了PsnICE 過表達小黑楊和對照小黑楊的基因表達譜,低溫脅迫下,共獲得1941個差異表達基因。其中,948個為上調(diào)表達基因,993個為下調(diào)表達基因。差異基因涉及植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、苯丙烷生物合成途徑、苯丙氨酸代謝等途徑。在這些差異基因中,包括與植物逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如WRKY、NAC、bHLH等。利用以轉(zhuǎn)錄因子為中心的酵母單雜交技術(shù)篩選確定PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子能識別5個順式作用元件,分別為 E-box、DRE-motif、C-box、ABRE-motif 和 Unknown1,其中Unknown1元件為未知功能的元件,確定其核心序列為:GATCA。酵母單雜交、瞬時轉(zhuǎn)化和EMSA結(jié)果進一步表明PsnICE1能夠與這5個順式作用元件結(jié)合。上述結(jié)果為深入研究小黑楊PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答低溫脅迫調(diào)控的分子機理及開展小黑楊抗寒分子育種提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S792.11
【圖文】：

（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ邋Ｍｏｓａｉｃ邋Ｖｉｒｕｓ邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。用邐基因啟動子替換邋ｐＢＩ１２１邋載體的逡逑ＣａＭＶ３５Ｓ啟動子，構(gòu)建與Ｇ⑵基因融合的植物表達載體ＰＢＩ１２１－ＰＯＴ／Ｃ五ｉ，如圖２－１。逡逑Ｈｉｎｄｌｌｌ邐Ｘｂａｌ逡逑—Ｎ邐邐逡逑ＬＢ邋－邋ＮＯＳ－Ｐ邋，邋ＮＰＴｌｌ邋ＮＯＳ－邐ＧＵＳ邋ＮＯＳ－Ｔ邋＿邋ｒｂ逡逑＿＿邐邐———＿＿＿逡逑圖２－１邐啟動子與ＧＣ／Ｓ基因融合示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰｓｎＩＣＥｌ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ＧＵＳ邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｓｉｏｎ逡逑根據(jù)毛果楊（ｉ＾ｒ／ｃ／ｚｏｃａｒｐａ）基因組中尸／／Ｃ五ｉ啟動子及５’ＵＴＲ序列，設(shè)計ＰｍＴＣｊＳｉ逡逑啟動子引物。根據(jù)ｐＢＩ１２１載體和尸？／Ｃ凡？啟動子序列的融合特性，在尸ｏｔ／Ｃ五ｉ啟動子逡逑的５’端和３’端分別引入限制性內(nèi)切酶／／／ｎ沿／／和的酶切位點

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邐東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑１０邐２０邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐９０邐１００逡逑？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋－邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？？邋？邋Ｉ邋－邋－邐Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋－邐？邋？邋？邋Ｉ逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2805162