【摘要】：低溫會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響,已有研究表明,ICE1基因在低溫條件下可以特異性結(jié)合CBF3啟動(dòng)子中的MYC順式作用元件,進(jìn)而誘導(dǎo)CBF3調(diào)控的一系列下游基因的表達(dá),在植物低溫脅迫應(yīng)答中具有重要的功能。本研究以小黑楊(Populus simonii×Pnigra)為研究對(duì)象,克隆PsnICE1基因及其啟動(dòng)子序列。序列比對(duì)結(jié)果顯示,小黑楊PsnICE1保守結(jié)構(gòu)域序列與其他物種同類的ICE1蛋白序列有較高的一致性,小黑楊PsnICE 1蛋白與其他物種ICE1蛋白序列相比,bHLH功能域以及C端高度保守,但N端序列保守性較低。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)研究發(fā)現(xiàn),小黑楊PsnICE1基因與蓖麻、甜楊親緣關(guān)系較近。克隆獲得PsnICE1基因上游1247 bp啟動(dòng)子序列,通過(guò)PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),該段序列中含有典型的真核生物核心啟動(dòng)子區(qū)域,除了包含TATA-box、CAAT-box等基本順式作用元件外,還存在其它可能與逆境脅迫誘導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的作用元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box 和MYCCONSENSUSATHSE等,這些元件有些與逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān),這表明PsnICE1基因可能與逆境脅迫相關(guān),在小黑楊抵御逆境脅迫的生理過(guò)程中具有重要功能。構(gòu)建pROK2-PsnICE1-GFP載體,利用基因槍技術(shù),將PsnICE1和GFP融合表達(dá)載體通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞,進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究,結(jié)果顯示,PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。利用qRT-PCR研究小黑楊PsnICE1基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式,結(jié)果顯示,PsnICE1基因在根、莖、葉中均有表達(dá),其表達(dá)量從脅迫1.5到72 h之間一直呈上調(diào)趨勢(shì),且在72 h時(shí)達(dá)到峰值,表明PsnICE1基因能夠被低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性,轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在N端第66-137氨基酸內(nèi)。為了分析PsnICE1基因是否具有抗寒功能,構(gòu)建了PsnICE1基因過(guò)表達(dá)載體pROK2-PsnICE1及抑制表達(dá)載體pFGC5941-PsnICE1,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過(guò)表達(dá)與抑制表達(dá)小黑楊植株。分別利用組織化學(xué)染色分析了低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因小黑楊的H202、02-含量及細(xì)胞膜透性,并進(jìn)一步測(cè)定了抗逆相關(guān)生理指標(biāo),包括MDA、H202含量、相對(duì)電導(dǎo)率、脯氨酸含量等的變化情況。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)小黑楊的MDA、H202含量和相對(duì)電導(dǎo)率最低,細(xì)胞膜完整性最好,而PsnICE1抑制表達(dá)植株的MDA、H2O2和02-含量及相對(duì)電導(dǎo)率最高,細(xì)胞膜損傷最嚴(yán)重。此外,PsnICE1基因能夠通過(guò)調(diào)控SOD和POD基因的表達(dá),來(lái)提高SOD和POD的活性,從而降低ROS在低溫脅迫下的積累。以上結(jié)果表明PsnICE1基因過(guò)表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因小黑楊的抗低溫能力。利用RNA-seq技術(shù)分析了PsnICE 過(guò)表達(dá)小黑楊和對(duì)照小黑楊的基因表達(dá)譜,低溫脅迫下,共獲得1941個(gè)差異表達(dá)基因。其中,948個(gè)為上調(diào)表達(dá)基因,993個(gè)為下調(diào)表達(dá)基因。差異基因涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、苯丙烷生物合成途徑、苯丙氨酸代謝等途徑。在這些差異基因中,包括與植物逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如WRKY、NAC、bHLH等。利用以轉(zhuǎn)錄因子為中心的酵母單雜交技術(shù)篩選確定PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子能識(shí)別5個(gè)順式作用元件,分別為 E-box、DRE-motif、C-box、ABRE-motif 和 Unknown1,其中Unknown1元件為未知功能的元件,確定其核心序列為:GATCA。酵母單雜交、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和EMSA結(jié)果進(jìn)一步表明PsnICE1能夠與這5個(gè)順式作用元件結(jié)合。上述結(jié)果為深入研究小黑楊PsnICE1轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答低溫脅迫調(diào)控的分子機(jī)理及開(kāi)展小黑楊抗寒分子育種提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S792.11
【圖文】：

（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ邋Ｍｏｓａｉｃ邋Ｖｉｒｕｓ邋３５Ｓ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ）。用邐基因啟動(dòng)子替換邋ｐＢＩ１２１邋載體的逡逑ＣａＭＶ３５Ｓ啟動(dòng)子，構(gòu)建與Ｇ⑵基因融合的植物表達(dá)載體ＰＢＩ１２１－ＰＯＴ／Ｃ五ｉ，如圖２－１。逡逑Ｈｉｎｄｌｌｌ邐Ｘｂａｌ逡逑—Ｎ邐邐逡逑ＬＢ邋－邋ＮＯＳ－Ｐ邋，邋ＮＰＴｌｌ邋ＮＯＳ－邐ＧＵＳ邋ＮＯＳ－Ｔ邋＿邋ｒｂ逡逑＿＿邐邐———＿＿＿逡逑圖２－１邐啟動(dòng)子與ＧＣ／Ｓ基因融合示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＰｓｎＩＣＥｌ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ＧＵＳ邋ｇｅｎｅ邋ｆｕｓｉｏｎ逡逑根據(jù)毛果楊（ｉ＾ｒ／ｃ／ｚｏｃａｒｐａ）基因組中尸／／Ｃ五ｉ啟動(dòng)子及５’ＵＴＲ序列，設(shè)計(jì)ＰｍＴＣｊＳｉ逡逑啟動(dòng)子引物。根據(jù)ｐＢＩ１２１載體和尸？／Ｃ凡？啟動(dòng)子序列的融合特性，在尸ｏｔ／Ｃ五ｉ啟動(dòng)子逡逑的５’端和３’端分別引入限制性內(nèi)切酶／／／ｎ沿／／和的酶切位點(diǎn)

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邐東北林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑１０邐２０邐３０邐４０邐５０邐６０邐７０邐８０邐９０邐１００逡逑？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋－邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邐？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？？邋？邋Ｉ邋－邋－邐Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邐？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋？邋？邋？邋？邋Ｉ邋－邐？邋？邋？邋Ｉ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2805162