【摘要】：胡楊(Populus euphratica)和灰楊(P.pruinosa)是一對(duì)近期分化的姊妹物種,對(duì)鹽脅迫有著極強(qiáng)的耐受能力;但灰楊對(duì)鹽脅迫的耐受能力更強(qiáng)。兩個(gè)物種均分布在干旱鹽堿的荒漠地區(qū),是我國西北荒漠重要的造林物種,對(duì)西北沙漠與荒漠生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的維持起著關(guān)鍵作用。我們利用第二代測序轉(zhuǎn)錄組研究手段對(duì)胡楊和灰楊的鹽脅迫下的基因表達(dá)變化式樣進(jìn)行了深入研究。1.胡楊與灰楊與其他非耐鹽楊樹對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的差異與胡楊和灰楊相反,毛果楊和毛白楊是兩個(gè)鹽敏感的楊樹。為了鑒定這些楊樹對(duì)鹽脅迫的不同響應(yīng)基因,我們比較了四種楊樹愈傷組織在持續(xù)鹽脅迫下轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)狀況。四種楊樹鑒定的直系同源基因有7822條,在其中找到了702條差異表達(dá)基因。通過層級(jí)聚類得到的基因共表達(dá)模式顯示,這鹽敏感楊樹和兩種耐鹽楊樹在鹽脅迫下的基因表達(dá)有顯著的差別。在鹽敏感楊樹物種,我們找到了6個(gè)基因?qū)}脅迫有一致性響應(yīng),包括6磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase 4),棉子糖合成酶(raffinose synthase),熱激蛋白20(hsp20),WRKY,過氧化物酶15(peroxidase 15),脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase),這些基因與植物廣譜的抗逆以及能量代謝相關(guān)。在兩個(gè)耐鹽楊樹中我們找到了5個(gè)基因在鹽脅迫中保持一致的響應(yīng),包括氧化還原酶(oxidoreductase activity),過氧化物酶(peroxidase),NADH,細(xì)胞色素p450(cytochrome P450)和GDSL脂肪酶(lipase GDSL);已有研究表明這些基因與植物耐鹽高度相關(guān)。2.胡楊和灰楊鹽脅迫下萌發(fā)種子的比較轉(zhuǎn)錄組比較胡楊和灰楊都具有耐鹽能力,但是在耐鹽能力上灰楊要略勝一籌。我們利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)來研究不同鹽濃度處理下兩個(gè)物種萌發(fā)種子的表達(dá)譜,來探究他們耐鹽的異同。我們發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的升高,兩個(gè)物種細(xì)胞內(nèi)核糖體以及能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)量均受到了顯著的抑制,包括14個(gè)核糖體相關(guān)基因(圖3.10)、糖酵解反應(yīng)中非常關(guān)鍵的果糖1-6二磷酸脫氫酶(MSTRG.17398.2)和一個(gè)參與到光呼吸中的氨基轉(zhuǎn)移酶(CCG021502.1)。兩個(gè)物種同時(shí)響應(yīng)鹽脅迫高表達(dá)與二者耐鹽脅迫相關(guān)的共有基因包括海藻糖磷酸化酶(TRP,MSTRG.15348.2)、去泛素化特異性蛋白酶(UBP9,MSTRG.23479.3)以及GDSL脂肪酶(GLIP1,CCG030033.1)�；覘畋群鷹罡幽望}的主要原因可能是該物種在高濃度脅迫下能夠維持更多抗逆相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá),如SCARECROW-like 8基因(CCG030097.1)、維生素B6合成酶(PDX1,CCG023950.1)、幾丁質(zhì)誘導(dǎo)子受體激酶(CERK1,MSTRG.17436.3)、過氧化氫酶2(CATALASE 2,MSTRG.2944.19)以及乙酰乳酸合成催化酶(CSR1,CCG012489.1);特別是灰楊關(guān)閉了兩個(gè)耐鹽有害基因的轉(zhuǎn)錄,一個(gè)是蛋氨酸裂解酶(MGL,MSTRG.26043.4),該基因的高表達(dá)使擬南芥對(duì)氧化脅迫更加敏感;另外一個(gè)是一個(gè)NUDX家族的水解酶,擬南芥中敲除該基因會(huì)使擬南芥的NADPH循環(huán)效率增高、耐鹽性增加。關(guān)閉這兩個(gè)基因有可能是灰楊更加耐鹽的關(guān)鍵原因之一,當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S792.11;Q943.2
【圖文】：

圖 2.1 胡楊、灰楊、毛果楊和毛白楊的轉(zhuǎn)錄組中基因表達(dá)量分布結(jié)果Figure 2.1 The RPKM distribution in each time point for four Populus.物種聚在一起，這也就說明這兩個(gè)鹽耐受物種和兩個(gè)鹽敏感物種的基因表達(dá)模式具有顯著的差異。這說明胡楊和灰楊這兩個(gè)鹽耐受物種與毛果楊和毛白楊這兩個(gè)鹽敏感物種，可能在各自的祖先分枝上就存在不同的基因表達(dá)適應(yīng)性進(jìn)化。另外，我們還發(fā)現(xiàn)胡楊和灰楊的兩個(gè) 0h 樣本聚在了一起，而這兩個(gè)物種的鹽脅迫樣品卻分開了；這說明在適應(yīng)不同的鹽生境時(shí)，這胡楊和灰楊這對(duì)近緣種存在不同的調(diào)節(jié)式樣，在代謝通路中存在適應(yīng)性分化。這些結(jié)果也與之前的研究結(jié)果相一致[25, 27, 28]表 2.2 四個(gè)物種的蛋白編碼基因和直系同源基因數(shù)量Table 2.2 Summary of gene number and orthologous pairsFeature ValueNumber of predicted genes (CDS)

15圖 2.2 胡楊、灰楊、毛果楊和毛白楊的 7752 個(gè)直系同源基因的 RPKM 層級(jí)聚類分析。Figure 2.2 Hierarchical clustering of all samples by spearman correlations based on RPKM of7,752 orthologous genes.接下來，我們利用軟件 edgeR 對(duì)每個(gè)物種的時(shí)間序列鑒定差異表達(dá)基因。我們選擇的差異表達(dá)基因需要滿足以下三個(gè)條件:（1）Rpkm 值在所有樣本的分布中標(biāo)準(zhǔn)差大于 1（2）log2 (FPKMtime1/FPKMtime2) was > 1 或者 < -1，（3）顯著性檢驗(yàn)的 p 值（FDR）＜0.05。最終在胡楊、灰楊、毛果楊和毛白楊中分別共鑒定了 1461，1906，1776，2400 個(gè)上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因（圖 2.3a，2.3b）。為了進(jìn)一步對(duì)四個(gè)物種進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，我們將所有的差異表達(dá)基因和 7822 個(gè) 1:1 的直系同源基因集取交集，共得到 1335 個(gè)差異表達(dá)的直系同源基因，然后我們篩選在任何物種中都要滿足 RPKM 值至少在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上＞0 的差異表達(dá)基因，最后共有 702 個(gè)差異表達(dá)的直系同源基因用于后續(xù)的分

圖 2.3 胡楊、灰楊、毛果楊和毛白楊兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因數(shù)量。黃色為上調(diào)，藍(lán)色為下調(diào)(倍數(shù)變化> 2 或< 0.5, FDR < 0.05)。(a) 兩個(gè)耐鹽物種差異表達(dá)基因（胡楊（下半部分）和灰楊（上半部分）.(b) 兩個(gè)鹽敏感物種差異表達(dá)基因（毛果楊（下半部分）和毛白楊（上半部分）。(c)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩物種直系同源基因差異表達(dá)基因餅圖。Figure 2.3 Number of differentially expressed genes showing up- (orange) or down- (blue)regulationbetween two time points (foldchange>2 or< 0.5, FDR < 0.05). (a)Thenumber of DEGsin the two salt-tolerant species (P. euphratica (Lower half) and P. pruinosa (Upper half)). (b) Thenumber of DEGs in the two salt-sensitive species (P. trichocarpa (Lower half) and P. tomentosa(Upper half)). (c) Venn diagram of differentially expressed orthologous genes in the four species atany pair of time points.析研究（圖 2.3c）；其中有 109 個(gè)是兩個(gè)鹽耐受物種特有的，287 個(gè)和 159 個(gè)基因分別只在灰楊和胡楊中特異性表達(dá)；73 個(gè)是兩個(gè)鹽敏感物種共有的、不同于鹽耐受物種的差異表達(dá)基因，另有 378 個(gè)和 46 個(gè)基因分別只在毛白楊和毛果楊中特異性表達(dá)（圖 2.3c）。

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