【摘要】：國槐(Sophora japonica L.),原產(chǎn)于我國北方,是一種集食用、藥用、用材、城市園林綠化、觀賞于一體的樹種。植物原生質(zhì)體是僅由原生質(zhì)膜包裹的裸露的活細胞,由于沒有細胞壁的阻礙,且具備細胞的全能性,個體間相互獨立,均勻程度較高的特點,所以被廣泛用在基礎(chǔ)生命科學(xué)與作物育種改良中。目前尚未有國槐原生質(zhì)體分離方面的研究報道,本研究通過對原生質(zhì)體分離流程及葉片最佳分離時期、酶液組合濃度的優(yōu)化和分離條件的確定,建立起國槐葉肉細胞原生質(zhì)體分離體系,為國槐后續(xù)深入進行基因?qū)W及其他分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.原生質(zhì)體分離流程及葉片最佳分離時期的確定通過參考不同植物葉肉原生質(zhì)體分離方法,本研究以國槐葉片為材料進行原生質(zhì)體分離,根據(jù)分離效果對分離流程加以改良,最終確定了適宜國槐葉肉原生質(zhì)體分離的配制酶液、原生質(zhì)體分離與純化和原生質(zhì)體計數(shù)與活力測定的方法。在溫室播種培育國槐幼苗,選取不同葉齡葉片進行分離試驗,其結(jié)果表明:10~15d的葉片分離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力均較高,且這些葉齡之間的分離效果沒有顯著差別;葉齡大于15d,國槐原生質(zhì)體產(chǎn)量顯著下降,并且出現(xiàn)細胞壁無法降解的帶壁單個細胞,因此10~15d葉齡國槐實生苗葉片為最佳分離時期。2.酶液組合濃度的優(yōu)化在2018年9月、2019年3月和4月三個時期在溫室播種培育國槐幼苗進行分離試驗。以纖維素酶R-10(1.0%、1.5%、2.0%和2.5%)、果膠酶Y-23(0.2%、0.3%、0.4%和0.5%)和離析酶R-10(0.8%、1.0%、1.2%和1.4%)為基礎(chǔ),進行正交試驗L_(16)(4~5)。最終確定優(yōu)化后的酶液組合濃度為:2018年9月,2.0%纖維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23+1.0%離析酶R-10;2019年3月,1.5%纖維素酶R-10+0.3%果膠酶Y-23+0.8%離析酶R-10;2019年4月,1.5%纖維素酶R-10+0.4%果膠酶Y-23+1.4%離析酶R-10。3.原生質(zhì)體分離條件的遴選通過對酶液滲透壓、酶解時間、酶解溫度、酶液酸堿度和材料預(yù)處理進行單因素實驗,最終確定不同試驗時期國槐葉肉原生質(zhì)體分離條件及其對應(yīng)結(jié)果為:2018年9月,在含有0.5M甘露醇的CPW洗液中質(zhì)壁分離1小時后,置于2.0%纖維素酶R-10+0.5%果膠酶Y-23+1.0%離析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH為5.7的酶液中,在26℃條件下酶解2.5h,其原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力分別為8.02×10~6gFW~(-1)和84.1%。2019年3月,在含有0.5M甘露醇的CPW洗液中質(zhì)壁分離1小時后,置于1.5%纖維素酶R-10+0.3%果膠酶Y-23+0.8%離析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH為5.7的酶液中,在26℃條件下酶解3h,其原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力分別為8.48×10~6gFW~(-1)和84.4%。2019年4月,在0.5M甘露醇滲透壓質(zhì)壁分離處理1h后,置于1.5%纖維素酶R-10+0.4%果膠酶Y-23+1.4%離析酶R-10,0.4mol/L甘露醇,pH為5.7的酶液中,在26℃條件下酶解3h,其原生質(zhì)體產(chǎn)量與活力分別為8.37×10~6gFW~(-1)和83.1%。4.不同生長季國槐原生質(zhì)體分離酶液組合濃度及分離條件試驗結(jié)果的差異,原因是試驗期間溫度與光照條件的不同導(dǎo)致植物細胞生理狀況、植物細胞壁成分不同。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S792.26

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本文編號：2791609