【摘要】：松枯梢病是一種由松球殼孢菌(Sphaeropsis sapinea)引起的世界性松樹病害,其廣泛分布于五大洲30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。該病害危害樹種多、發(fā)生面積大、發(fā)展迅速,造成的損失不亞于松材線蟲病造成的損失。改善營(yíng)林措施和使用化學(xué)藥劑是現(xiàn)階段防治松枯梢病的主要方式,但兩者都存在不足。生物防治已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外植物病害防治的重要手段和發(fā)展方向,很多從植物體內(nèi)與植物根際土壤中篩選出的微生物能有效防治病蟲害,并且對(duì)植物有促生作用。本文以松球殼孢菌為指示菌,從感病松林健壯濕地松莖段中分離篩選出具有良好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌JK-AH7,先后對(duì)其進(jìn)行了種屬鑒定、抗松枯梢病機(jī)制探討、松樹體內(nèi)定殖狀況驗(yàn)證以及代謝產(chǎn)物發(fā)酵優(yōu)化,并與其他有益菌株一并開展了野外應(yīng)用試驗(yàn)。主要研究結(jié)果如下:從健壯濕地松莖段共分離出11株內(nèi)生細(xì)菌,以松球殼孢菌為指示菌,按照生長(zhǎng)較快、抑菌能力強(qiáng)及抑菌持續(xù)力久等標(biāo)準(zhǔn)篩選得到菌株JK-AH7,其對(duì)擬莖點(diǎn)霉、棕櫚疫霉等十二種病原真菌均具有拮抗能力。經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化、16s rDNA序列比對(duì)以及特異性引物擴(kuò)增,確定菌株JK-AH7為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。通過在拮抗作用下對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和不同濃度發(fā)酵產(chǎn)物抑菌率的觀察統(tǒng)計(jì),以及自身產(chǎn)抑菌物質(zhì)能力和誘導(dǎo)濕地松抗病效果酶活的測(cè)定,從而對(duì)菌株JK-AH7抗病機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果顯示,菌株JK-AH7能使病原菌菌絲產(chǎn)生頂端膨大、分支增加、扭曲變形等現(xiàn)象;能夠抑制松球殼孢菌孢子萌發(fā);發(fā)酵產(chǎn)物10%濃度添加量對(duì)松球殼孢菌抑制率達(dá)到89.7%;能夠分泌纖維素酶、磷酸酯酶和蛋白酶等,具有一定的解有機(jī)磷能力;在接種松球殼孢菌后,經(jīng)過菌株JK-AH7處理的濕地松防御酶SOD、POD、PPO活性得到增強(qiáng),而抗病物質(zhì)MDA、Pro含量則保持較低水平,表明了菌株JK-AH7能夠增強(qiáng)濕地松抗松枯梢病能力,可作為一種防治松枯梢病的候選生防菌株。采用GFP標(biāo)記方法和掃描電鏡觀察對(duì)JK-AH7菌株在松樹體內(nèi)定殖進(jìn)行驗(yàn)證。激光共聚焦結(jié)果表明,在施菌30d后,在濕地松根系能夠檢測(cè)到標(biāo)記菌株。掃描電鏡對(duì)松樹無菌苗施加菌株JK-AH7培養(yǎng)40d后的觀察結(jié)果表明,JK-AH7能夠在濕地松莖段進(jìn)行定殖。兩種驗(yàn)證結(jié)果說明JK-AH7菌株能在松樹體內(nèi)良好的定殖并且存續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),表明JK-AH7菌株為內(nèi)生細(xì)菌,具有生防潛能。為提高菌株JK-AH7菌體量與發(fā)酵代謝產(chǎn)物抑菌能力,通過單因素法、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件為:麥芽糖3g/L,胰化蛋白胨20g/L,硫酸鎂12g/L,初始pH=6,培養(yǎng)時(shí)間60h,培養(yǎng)溫度28℃,接種量6%,裝液量80mL,轉(zhuǎn)速200rpm,為后續(xù)獲得具有抑菌能力的發(fā)酵代謝產(chǎn)物提供技術(shù)支持。在白馬基地與老嘉山林場(chǎng),對(duì)菌株JK-AH7與其他幾株促生抗病菌株,采用施菌方式復(fù)合、濃度配比、菌株復(fù)配等進(jìn)行野外應(yīng)用試驗(yàn)。在白馬實(shí)驗(yàn)基地和老嘉山林場(chǎng)部隊(duì)試驗(yàn)區(qū),對(duì)一年生黑松、馬尾松、濕地松蘸漿施菌處理,JZ-GX1對(duì)馬尾松和濕地松促生效果顯著,第二年對(duì)黑松、馬尾松、濕地松復(fù)施后,除FZB42對(duì)馬尾松作用效果不明顯外,NSM-05、JW-JS1、JZ-GX1、JK-JS7均有促生效果;在老嘉山林場(chǎng)汪家壩試驗(yàn)區(qū),不同濃度菌株對(duì)三年生濕地松噴霧處理后,兩年監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,除100mL/株NSM-05菌株外,各濃度NSM-05、JK-JS7以及NSM-05+JK-JS7均有不同程度促生效應(yīng);不同施菌方式對(duì)三年生濕地松施菌后,兩年監(jiān)測(cè)結(jié)果表明,菌株NSM-05采用噴霧處理促生效果更好,JK-JS7+NSM-05采用灌根或者注干效果較好,但與單施菌株差異不明顯;在老嘉山林場(chǎng)老場(chǎng)部東試驗(yàn)區(qū),采用灌根與噴霧復(fù)合施菌方式對(duì)三年生濕地松進(jìn)行施菌處理,FZB42+JK-AH7、FZB42+NSM-05與JZ-GX1+NSM-05促生效果明顯,對(duì)松枯梢病的防效上,JZ-GX1+JK-AH7、FZB42+JK-JS7、FZB42+JK-SH007、FZB42+NSM-05表現(xiàn)良好;對(duì)老嘉山林場(chǎng)余灣濕地松兩年監(jiān)測(cè)表明,JZ-GX1、JW-JS1、FZB42、NSM-05、NSM-05+JZ-GX1、NSM-05+JW-JS1均具有較好較持續(xù)的促生效果,各處理對(duì)株高和地徑促生各有側(cè)重。
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S763
【圖文】：

命名為 JK-AH7(圖2-1)。培養(yǎng) 2d 培養(yǎng) 40d圖 2-1 拮抗細(xì)菌對(duì)松球殼孢菌的抑制效果Fig.2-1 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on Sphaeropsis sapinea3.2 拮抗菌株復(fù)篩及其抑菌譜將上述初篩菌株 JK-AH7 與本實(shí)驗(yàn)室原有的拮抗菌株 NSM-05、JK-SH007、JK-JS7 同時(shí)進(jìn)行平皿拮抗比較試驗(yàn)，復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果表明(圖 2-2)，JK-AH7 菌株的抑菌能力較強(qiáng)，對(duì)松球殼孢菌的抑菌能力稍弱于 JK-SH007，強(qiáng)于 NSM-05 及 JK-JS7，是一株有良好拮抗效果的生防候選菌株。

itory ability of JK-AH7 and JK-SH007,Sphaeropsis sapinea疫霉等十二種病原真菌作抑菌譜的拮抗效果(如表 2-1 所示)，對(duì)膠表 2-1 JK-AH7 抑菌譜1Antimicrobial spectrum of strain JK-A病原菌 抑菌能力莖點(diǎn)霉 ++櫚疫霉 +輪斑病菌 ++紋葉枯病菌 ++鏈格孢 ++黃殼囊孢 ++椒疫霉 ++

G 辣椒疫霉 H 擬盤多毛孢 I 交鏈孢 J 膠胞炭疽 K 殼梭孢 L 松脂潰瘍病菌圖 2-3 拮抗細(xì)菌對(duì) 12 種病原真菌的抑制效果Fig.2-3 Inhibitory effect of antagonistic bacteria on 12 pathogenic fungi3 JK-AH7 菌株的種屬鑒定3.1 形態(tài)觀察與染色結(jié)果如圖 2-4 所示，在 NA 平板上培養(yǎng) 24h 后，JK-AH7 菌株的菌落呈現(xiàn)白色，半透明，光濕潤(rùn)的菌落，稍隆起，圓形齊整，具有粘性。革蘭氏染色結(jié)果表明，JK-AH7 在顯微鏡呈現(xiàn)藍(lán)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌。芽孢染色結(jié)果表明，拮抗細(xì)菌兩端被染成黑色，中間出中空透明，則表明 JK-AH7 能產(chǎn)生芽孢，為芽孢桿菌且為中生芽孢。

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3 劉秀]

本文編號(hào)：2772045