【摘要】：許多野生植物攜帶抗旱、抗寒和抗鹽堿等抗性基因,對農(nóng)作物改良和增加農(nóng)作物多樣性極其重要,是農(nóng)業(yè)育種的“基因庫”,高通量和低成本的DNA和RNA測序技術(shù)極大地加快了這些基因的挖掘。我們首次對樟子松Pinus sylvestris L.var.mongolica Litv.(中國東北部的常綠松樹)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定出一種新型的鈣調(diào)素類蛋白編碼基因PsCML1(Pinus sylvestris CALMODULIN-LIKE),在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中并未發(fā)現(xiàn)與PsCML1同源的蛋白,結(jié)果表明PsCML1是樟子松特異蛋白,對其生理功能進(jìn)行研究。主要實驗研究結(jié)果如下:(1)對PsCML1蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果顯示其N-末端具有一個非胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、1個單跨膜結(jié)構(gòu)域和在C-末端具有4個EF-Hand結(jié)構(gòu)域(Ca~(2+)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。通過MicroCal ITC200等溫滴定量熱法分析,我們發(fā)現(xiàn)PsCML1蛋白的EF-Hand結(jié)構(gòu)域確實可以與Ca~(2+)結(jié)合。(2)將PsCML1在煙草葉片中進(jìn)行亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)PsCML1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。(3)在擬南芥中異源表達(dá)PsCML1基因,發(fā)現(xiàn)PsCML1可以促進(jìn)幼苗的生長,并可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對鹽脅迫和低Ca~(2+)脅迫的抗性。通過統(tǒng)計PsCML1轉(zhuǎn)基因植物和野生型根尖分生組織(Root Apical Meristem,RAM)的細(xì)胞數(shù)目和長度,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的分生區(qū)顯著長于野生型,分生區(qū)的細(xì)胞數(shù)目明顯多于野生型,但是分生區(qū)細(xì)胞長度無顯著差異,這表明PsCML1基因促進(jìn)擬南芥根生長。(4)因為細(xì)胞壁組分的生物合成與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)糖基化和活性氧穩(wěn)態(tài)相關(guān),采用Immunoblotting測定PsCML1對蛋白質(zhì)糖基化的影響;采用H_2O_2特異探針二氫羅丹明(DHR)測定植物根的H_2O_2水平。結(jié)果顯示Ps CML1對擬南芥蛋白質(zhì)糖基化無影響;PsCML1提高了植物H_2O_2水平,可能是由于H_2O_2含量的提高造成細(xì)胞壁組分的改變。PsCML1蛋白的鑒定和生理功能的研究為日后野生植物特異抗性相關(guān)基因提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S791.253
【圖文】：

鈣（Ca）是響應(yīng)生物和非生物脅迫的重要第二信使。Ca感應(yīng)各種環(huán)境脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Ca2+存在于植物胞質(zhì)和細(xì)胞器[2,3]。Ca2+濃度的變化（Ca2+信號）參與調(diào)控 Ca2平修飾細(xì)胞活性。Ca2+在植物中的重新分配主要取決于 Ca2+[2,3]。 Ca2+濃度是由對 Ca2+具有不同親和力的蛋白質(zhì)感受到的，這d 結(jié)構(gòu)域，一種高度保守的螺旋-環(huán)-螺旋的 Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)的存在個 Ca2+離子，Ca2+信使系統(tǒng)在植物中廣泛使用，而含有 EF-H導(dǎo) Ca2+作用的關(guān)鍵傳感器[5]。具有不同數(shù)量的 EF-Hand 結(jié)構(gòu)：（1）簡單的 Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物，沒有已知的功能結(jié)構(gòu)域，主相互作用，這類主要包括鈣調(diào)蛋白（CaM），鈣調(diào)素類蛋白白（CBL），（2）具有 Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域（如 EF-Hand）和另一功白激酶（CDPK））的蛋白質(zhì)。CaM 存在于所有真核生物中[

內(nèi)蒙古大學(xué) 碩士學(xué)位論文病原體感知信號級聯(lián)中的中間步驟的作用，導(dǎo)致先蛋白（CBL）與蛋白激酶 CIPK和動物中的神經(jīng)元 Ca2+傳感器的鈣調(diào)磷酸酶B的L 都有至少三個 EF 結(jié)構(gòu)域和 Ca2+結(jié)合位點[39,42]。激活來傳遞 Ca2+信號[43]。IPK 途徑在營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)中作為調(diào)節(jié)劑起作同離子的敏感性[44,45]。有一篇綜述闡述了在擬南，分類以及他們的表達(dá)模式，并著重介紹了 CBL 來的一些新的研究思路和方向[42]。

圖 2.1 pENTR 3C 載體質(zhì)粒圖譜與其多克隆位點信息igure 2.1 Map and multiclone site features of pENTR 3C vec產(chǎn)物用超微量紫外分光光度計測一下濃度，將目的進(jìn)行混合，加0.1 μL的T4 DNA 連接酶，1 μL的T反應(yīng) 1 h。4)-(8) 進(jìn)行實驗。的菌保菌，然后再通過 LR 反應(yīng)，將連接了 pENT粒與表達(dá)載體pGWB605進(jìn)行LR反應(yīng)：吸取3.5 μL因的質(zhì)粒與 0.5 μL pGWB 605 質(zhì)粒混合，再加入 迅速加入 1 μL 蛋白酶 K，37 °C、10 min，目的感受態(tài) DH5α。的 35S-PSCML1-GFP 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài) GV

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1 鄔彩麗;樟子松特有鈣調(diào)素類蛋白PsCML1生理功能研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

本文編號：2751016