【摘要】：巴西橡膠樹的生長(zhǎng)發(fā)育受多種生物和非生物脅迫的影響,其中白粉病是橡膠樹一種重要的葉部病害,會(huì)導(dǎo)致橡膠樹葉片大面積掉落,對(duì)橡膠樹的生長(zhǎng)和產(chǎn)量造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Mlo基因是植物特有的一類基因,其編碼的蛋白能夠參與多種細(xì)胞過程,其隱性等位基因mlo對(duì)白粉病具有持久的抗性,但橡膠樹中有關(guān)Mlo基因及其功能鮮有報(bào)道。為探究橡膠樹Mlo基因的結(jié)構(gòu)和功能,本研究通過生物信息學(xué)分析,在橡膠樹葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行全面的搜索和鑒定;采用分子生物學(xué)技術(shù),克隆、鑒定并分析HbMlos的結(jié)構(gòu)與功能,并用于抗病品種的篩選;對(duì)克隆得到的HbMlos基因在白粉菌侵染、逆境脅迫和植物激素等誘導(dǎo)下的基因表達(dá)模式進(jìn)行分析;采用瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)確定橡膠樹HbMlo12蛋白的亞細(xì)胞定位;采用遺傳轉(zhuǎn)化,獲得過表達(dá)HbMlo12基因的擬南芥植株,分析轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的表型以及對(duì)干旱脅迫、白粉菌侵染的響應(yīng)情況。結(jié)果如下:1.從橡膠樹中新克隆了 2個(gè)Mlo基因,可能參與橡膠樹的脅迫響應(yīng)過程。HbMlol-1和HbMlo7是由510和499個(gè)氨基酸組成的穩(wěn)定性疏水蛋白,定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。二者均存在一個(gè)Mlo家族保守結(jié)構(gòu)域,7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。HbMlo1-1和HbMlo7基因在莖、葉片、花、膠乳和樹皮中均有表達(dá)。在白粉菌侵染后,HbMlo1-1上調(diào)表達(dá),HbMlo7下調(diào)表達(dá),其表達(dá)還受到機(jī)械傷害、干旱脅迫以及H2O2、ABA、ETH和MeJA的誘導(dǎo),但兩基因在結(jié)構(gòu)上不具有與白粉病相關(guān)的保守結(jié)構(gòu)域。2.對(duì)已克隆的橡膠樹HbMlos和其他物種中已知功能的Mlo進(jìn)行結(jié)構(gòu)和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),HbMlo12含有與白粉病抗性相關(guān)的兩段保守結(jié)構(gòu)域和鈣調(diào)素結(jié)合蛋白區(qū)域。HbMlo12與雙子葉植物中已知具有廣譜抗性的Mlo (SIMlo1、AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12等)聚在第V分支上,在白粉病的誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá),因此推測(cè)HbMlo12最可能是橡膠樹中與白粉病抗性相關(guān)的Mlo基因。3.同一HbMlo在橡膠樹不同抗、感品種中表達(dá)水平各異,不同HbMlos在同一品種中的表達(dá)量也不同,其表達(dá)與抗、感表型之間沒有明顯的相關(guān)性。4.HbMlo12定位于細(xì)胞質(zhì)中,獲得了轉(zhuǎn)HbMlo12基因擬南芥純合植株。通過比較不同株系擬南芥生長(zhǎng)狀況,發(fā)現(xiàn)HbMlo12/Col-0和HbMlo12/Atmlo2-9轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長(zhǎng)狀況劣于野生型Col-O植株,HbMlo12對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的影響。在干旱脅迫下,轉(zhuǎn)基因擬南芥的抽薹時(shí)間較野生型晚,HbMlo12在一定程度上增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥在幼苗期的耐旱能力。在橡膠樹白粉菌侵染下,通過觀察接種部位的變化,初步推斷四種擬南芥株系的感病能力為:Col-0HbMlo2/Col-0HbMlo2/Atmlo2-9Atmlo2-9,由此可以推測(cè),HbMlo12在轉(zhuǎn)基因擬南芥與橡膠樹白粉菌的親和性互作中具有一定的作用。5.通過HbMlo12鑒定發(fā)現(xiàn),與白粉病抗性相關(guān)的SNP位點(diǎn)可能有47個(gè),其中有41個(gè)是單堿基突變,在2762、2917和2922三個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)多堿基突變,2007和2781位點(diǎn)則出現(xiàn)多堿基的插入,960位點(diǎn)出現(xiàn)多堿基的丟失。根據(jù)以上結(jié)果,得出以下結(jié)論:1.HbMlo1-1和HbMlo7屬于Mlo家族成員,與干旱和機(jī)械傷害脅迫以及植物激素刺激有關(guān)。2.預(yù)測(cè)橡膠樹Mlo家族在橡膠樹的生長(zhǎng)、植物激素刺激以及非生物脅迫中均具有一定的功能,其中HbMlo12是橡膠樹中與白粉病抗性相關(guān)的Mlo基因。3.通過轉(zhuǎn)基因擬南芥研究發(fā)現(xiàn),HbMlo12參與轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育和干旱脅迫響應(yīng)過程。白粉菌侵染四種擬南芥株系,結(jié)果初步證明了HbMlo12在轉(zhuǎn)擬南芥植株中具有感橡膠樹白粉病的能力,表明HbMlo12是橡膠樹中白粉病廣譜抗性相關(guān)的候選基因。4.通過不同抗、感種質(zhì)中HbMlo12的序列分析,發(fā)現(xiàn)47個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),可用于開發(fā)SNP標(biāo)記篩選白粉病抗性種質(zhì)。本研究闡明了HbMlos基因家族在橡膠樹白粉病和逆境脅迫中的功能,為研究橡膠樹抗白粉病機(jī)制提供理論基礎(chǔ),為篩選和培育橡膠樹抗白粉病種質(zhì)提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S763.7
【圖文】：

２．５邋ＨｂＭｌｏｌ２亞細(xì)胞定位檢測(cè)逡逑２．５．１融合表達(dá)載體構(gòu)建逡逑融合表達(dá)載體構(gòu)建原理如圖５。逡逑Ｒ）邐ｆ邐＼＾ｆｌｏｎ逡逑Ｓ＾Ｊ邐Ｉ邋—１：邋＼ｚ逡逑Ｔ邋ＭＷｔｈｐ邋Ｊ＇ｍ（，，Ｐ邐ｊＬ邋ＪＯＯＯｂｐ邋Ｔ逡逑ｖｌｙ，ｃｒ邋－Ｖ二ｙ逡逑l我镥雧韜灣義希攏睿恚蓉瓩丨刀位點(diǎn)．ＰＣＲ逡逑貪敵？切位點(diǎn)的丨丨ｂｌＶ丨ｌｏ丨２片段逡逑找體片段逡逑邐以鵠叻丨叫收１「Ｉ的片段逡逑Ｔ４迮拔的迮按逡逑Ｎｏｓ邋ｐｒｏ邋（，逡逑ｐｒ“逡逑Ｘｈｏｌ逡逑Ｂａｓｔａ產(chǎn)邐ｓＸ逡逑Ｍ邐Ｙ＼ＨｂＭＩ？．ｌ２逡逑Ｎｏｓ邋ｉｃｒＭ．邋３５Ｓ：邋Ｉ０Ａ１１？，１２：邋Ｉ；！邋Ｐ邐Ｕ－邋ＲａｍＨｌ逡逑ｙ邐ＩｍＧＦＰ逡逑Ｉ邐６９Ｏ０ｂｐ邐Ｔ＂逡逑ｖｌｙ；＾逡逑圖５基因過表達(dá)載體構(gòu)建原理圖逡逑Ｆｉｇ．邋５邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑（１）根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物（見表３）對(duì)進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)體逡逑系和程序如表８圖６：逡逑表８／／６Ｍ０／２邋ＰＣＲ擴(kuò)增體系逡逑Ｔａｂｌｅ邋８邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋ＨｂＭｌｏｌ２逡逑質(zhì)粒邋ＨｂＭｌｏｌ２邐１邋

機(jī)械傷害作用下，基因在處理０．５ｈ，表達(dá)水平顯著上調(diào)，是處理逡逑前的１．４倍。隨著機(jī)械傷害處理時(shí)間的延長(zhǎng)，基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著下降的趨逡逑勢(shì)（圖１５）。說明基因在橡膠樹機(jī)械傷害的早期被誘導(dǎo)表達(dá)。逡逑１．６邋－邋．逡逑Ａ逡逑ｆ邋１－４－邋N逡逑１邋１２邋“邋｜逡逑ｇ邋１．０逡逑０．８逡逑１ｌｌｉｉｉｉ逡逑０邋０．５邋１邋２邋６邋１２逡逑時(shí)間／Ｖｉ逡逑圖１５機(jī)械傷害處理下／／６Ｍ／０７－／基因的表達(dá)分析逡逑Ｆｉｇ．邋１５邋ＨｂＭｌｏｌ－１邋ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｍｅｃｈａｎｉｘａｌ邋ｗｏｕｎｄｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑３１逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2727988