【摘要】：巨桉(Eucalyptus grandis)是世界重要的速生與能源樹種,但其栽培種多為冷敏感型,且不耐高鹽、干旱等逆境。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的大型轉(zhuǎn)錄因子家族之一,不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程,還與逆境脅迫的適應(yīng)密切相關(guān)。通過對(duì)巨桉NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究,挖掘參與逆境響應(yīng)的關(guān)鍵NAC,有望為巨桉抗性分子輔助育種提供理論支持。通過生物信息學(xué)手段,在巨桉全基因組范圍內(nèi)鑒定出NAC轉(zhuǎn)錄因子基因成員,并在此基礎(chǔ)上結(jié)合前人的研究篩選出了其中的SNAC(stress responsive NAC)類基因,并對(duì)其成員的基因結(jié)構(gòu)、組織特異性表達(dá)以及低溫、高溫、干旱、高鹽等非生物逆境和ABA、MeJA處理下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。從中選擇了EgrNAC1、EgrNAC6進(jìn)行擬南芥異源轉(zhuǎn)化,進(jìn)行基因功能研究及其所參與的非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制的探討。同時(shí),結(jié)合生物信息學(xué)方法、轉(zhuǎn)錄組分析與酵母雙雜技術(shù),初步構(gòu)建了EgrNAC1、EgrNAC6參與低溫響應(yīng)的模型。主要結(jié)果如下:1.從巨桉基因組中鑒定得到166個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因成員,并在與其他物種中參與非生物逆境脅迫的NAC轉(zhuǎn)錄因子序列比對(duì)的基礎(chǔ)上,從中篩選出50個(gè)SNAC類基因。巨桉166個(gè)NAC基因在11條染色體上都有分布,其中1號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、9號(hào)和10號(hào)染色體分布相對(duì)密集;組織特異性表達(dá)分析表明:NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中表達(dá)差異可分成四大類,分別對(duì)應(yīng)在成熟葉片、莖尖與嫩葉、韌皮部、未成熟和成熟木質(zhì)部表達(dá)量較高,暗示其在不同組織中有特定表達(dá)的基因簇,協(xié)同參與、調(diào)控各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)激反應(yīng)。根據(jù)巨桉50個(gè)SNAC類基因在低溫、高溫、干旱、高鹽、ABA、MeJA六種處理?xiàng)l件下的定量表達(dá)數(shù)據(jù),分析了它們與不同非生物逆境因子的響應(yīng)關(guān)系。根據(jù)響應(yīng)逆境因子個(gè)數(shù),將其分成四大類:第Ⅰ類基因共計(jì)17個(gè),都能響應(yīng)6種逆境因子,根據(jù)響應(yīng)情況又細(xì)分為上調(diào)誘導(dǎo)型、高溫下調(diào)型、無規(guī)律型;第Ⅱ類19個(gè)基因,特征為響應(yīng)5種逆境條件,根據(jù)對(duì)激素的反應(yīng),又細(xì)分為響應(yīng)兩種激素型、只響應(yīng)ABA型、只響應(yīng)MeJA型;第Ⅲ類9個(gè)基因響應(yīng)3、4種逆境因子,細(xì)分為響應(yīng)兩種激素型、只響應(yīng)ABA型、只響應(yīng)MeJA型;第Ⅳ類5個(gè)基因不受激素調(diào)控,但其成員至少能響應(yīng)4種非生物逆境因子中2種及以上的脅迫因子。2.通過異源轉(zhuǎn)化擬南芥,研究了轉(zhuǎn)基因株系與野生型在低溫響應(yīng)方面的差異,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)EgrNAC1、EgrNAC6能通過CBF途徑增強(qiáng)擬南芥抗凍表型,在-6℃處理?xiàng)l件下,相對(duì)于野生型,EgrNAC1、EgrNAC6超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系成活率從30%提升到80%以上。這兩個(gè)基因參與擬南芥低溫響應(yīng)過程中,都能通過提高CBF1、CBF2的表達(dá)量,使下游低溫響應(yīng)基因RD29A表達(dá)上調(diào),從而參與低溫響應(yīng)。3.EgrNAC1、EgrNAC6參與ABA、高鹽與干旱響應(yīng)。EgrNAC1的超表達(dá)降低了擬南芥對(duì)ABA的敏感程度,但減弱了植株抗旱能力和耐鹽能力;EgrNAC6超表達(dá)降低了擬南芥對(duì)ABA的敏感程度,但同時(shí)增強(qiáng)了植株的抗旱與耐鹽能力。從EgrNAC6超表達(dá)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)EgrNAC6還可能受到MAPK信號(hào)途徑的調(diào)控,另外還可能涉及氧化磷酸化水平的調(diào)控、光合作用的下調(diào)、硫苷化合物的積累等,以此提高植株對(duì)低溫、干旱和高鹽的抵抗能力。4.通過生物信息學(xué)手段,我們預(yù)測(cè)了EgrNAC1、EgrNAC6與其他基因表達(dá)蛋白之間潛在的互作及調(diào)控關(guān)系,借助酵母雙雜技術(shù),我們對(duì)其中20個(gè)候選蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其中18個(gè)能與EgrNAC1或EgrNAC6發(fā)生互作的蛋白。根據(jù)這18個(gè)基因的低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),將其分成3類:前期響應(yīng)蛋白(RING-ZFP、HOMEZ1、MYB、C2H2、HOMEZ2、AP2/B3)、中期響應(yīng)蛋白(Dof1、Obp、SNAC3、ERF018)與后期響應(yīng)蛋白(AP2、NAC1、NAC6、WRKY、AN1-ZFP、SNAC35、SP、Dof2),分別對(duì)應(yīng)調(diào)控前期響應(yīng)基因、中期響應(yīng)基因、后期響應(yīng)基因。5.綜合研究的結(jié)果,我們提出了一個(gè)初步的EgrNAC1、EgrNAC6參與低溫響應(yīng)模型:當(dāng)?shù)蜏貋砼R時(shí),首先由ABA和MAPK信號(hào)途徑接收與傳遞信號(hào),將信號(hào)傳遞至EgrNAC1、EgrNAC6,使EgrNAC1、EgrNAC6的表達(dá)量上升;EgrNAC1、EgrNAC6通過招募其他NAC或者轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)控低溫相關(guān)基因的表達(dá);EgrNAC1、EgrNAC6也能通過上調(diào)CBF1、CBF2的表達(dá)量,提升低溫響應(yīng)下游基因RD29A等的表達(dá),產(chǎn)生氧化磷酸化水平下降、光合作用關(guān)閉、抗氧化酶活性上升、硫苷類物質(zhì)上升等一系列生理生化層面上的改變,提高植物對(duì)低溫的適應(yīng)性。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：Q943.2;Q945.78
【圖文】：

NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征

NAC轉(zhuǎn)錄因子在非生物逆境脅迫中的作用方式

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王亞紅;劉縉;王玉國(guó);;高質(zhì)量提取銀杏種仁總RNA的改良方法[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年15期

本文編號(hào)：2721220