【摘要】：毛白楊(Populus tomentosa)是我國特有的白楊派鄉(xiāng)土樹種,主要分布于黃河流域、淮河流域的10個省份,在林業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)保護和城鄉(xiāng)綠化占有重要地位。實踐中楊樹彩葉品種較少,不能滿足生態(tài)文明建設(shè)中“延綠增彩”的需求及市場對品種多樣化的趨勢。因此,開展毛白楊花青素合成途徑關(guān)鍵基因的克隆及其特性研究,并對其進行功能鑒定,對于闡明楊樹葉色變異的分子機制具有重要的理論意義,同時可為基因工程改良創(chuàng)制新的楊樹彩葉新品種提供有價值的候選基因。本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通過PCR方法克隆獲得毛白楊PtDFR基因,采用生物信息軟件進行了一系列特性分析,通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示該基因的表達模式。采用基因編輯技術(shù)--CRISPR/Cas9對楊樹MYB183進行了初步研究。為后續(xù)對毛白楊的遺傳改良及進一步解析毛白楊花青素合成途徑相關(guān)基因的功能奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下(1)根據(jù)毛白楊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計DFR基因PCR引物,通過PCR擴增獲得了毛白楊DFR基因家族的1個成員,命名為PtDFR。測序結(jié)果表明,該基因序列全長為1,59lbp,包含6個外顯子和5個內(nèi)含子,CDS長度為954bp,編碼317個氨基酸,具有1個NADP(H)保守結(jié)構(gòu)域和1個底物特異性結(jié)合位點。理化性質(zhì)和功能域分析表明,基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.06 kD,理論等電點為5.62,翻譯后的蛋白質(zhì)不是分泌蛋白且為親水性蛋白,具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列相似性分析,毛白楊與銀白楊、毛果楊DFR氨基酸相似性高達95.65%和94.21%,而與柑橘、棗、葡萄等7個物種DFR氨基酸相似性達到89.29%～82.14%。進化分析表明,毛白楊與毛果楊、銀白楊遺傳距離最近聚為一組,與單子葉植物小麥、水稻距離較遠。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,PtDFR在不同組織器官中的表達量存在明顯差異,在萌動營養(yǎng)芽表達量最高,休眠營養(yǎng)芽最低,在不同時期雌雄花芽表達趨勢相似。(2)利用CRISPR/Cas9技術(shù),依據(jù)毛果楊MYB183設(shè)計構(gòu)建了 6個單sgRN A靶點載體,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在毛白楊中進行了轉(zhuǎn)化。通過PCR篩選得到部分陽性株系,經(jīng)測序分析對比野生型與陽性轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn),6號靶點陽性轉(zhuǎn)基因植株發(fā)生了堿基的改變,進一步進行氨基酸比對分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系S9、S37與野生型株系氨基酸序列沒有發(fā)生變化,其原因可能同義突變或由于等位基因間序列存在差異導(dǎo)致編碼氨基酸沒有發(fā)生變化。
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S792.117
【圖文】：

Ａ：邋ＤＦＲ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ；邋Ｂ：邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｔｏｍｅｎｔｏｓａ＼逡逑Ｃ：邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＰｔＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑圖３－５毛白楊ＤＦＲ的信號肽、親水性／疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ，邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｎｄ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｏｆ逡逑Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ逡逑３．２．５毛白楊編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)逡逑利用ＳＯＰＭＡ在線分析軟件對ＤＦＲ蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（如圖３－６）逡逑顯示

逡逑圖５－２轉(zhuǎn)基因苗ＰＣＲ檢測圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋５－２邋ＰＣＲ邋ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｐｌａｎｔｌｅｔｓ逡逑將上述篩選出的陽性轉(zhuǎn)基因株系利用靶點兩端側(cè)翼序列特異引物進行ＰＣＲ逡逑反應(yīng)，獲得的產(chǎn)物進行切膠回收后送至公司進行測序，進一步的分析確定靶目標(biāo)逡逑位點序列是否發(fā)生變化。將野生型與陽性轉(zhuǎn)基因苗測序結(jié)果比對之后發(fā)現(xiàn)，靶點逡逑為ｓｇＲＮＡ６（圖５－２）的陽性轉(zhuǎn)基因苗發(fā)生了序列的變化，其中Ｓ９號株系（圖５－３）逡逑發(fā)生了多堿基的轉(zhuǎn)換，原本為ＴＴ堿基變?yōu)椋茫翂A基，ＣＡＧ堿基變?yōu)椋牵茫詨A基，Ｔ逡逑堿基變?yōu)椋翂A基；Ｓ３７號株系由ＴＴ堿基變?yōu)椋茫翂A基，ＧＴ堿基變?yōu)椋粒翂A基。逡逑利用ＤＮＡＭＡＮ軟件進行氨基酸比對，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系Ｓ９、Ｓ３７與野生型株系氨逡逑基酸序列沒有發(fā)生變化，這可能是由于氨基酸有多個對應(yīng)的密碼子，屬于同義密逡逑碼子

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本文編號：2720657