【摘要】：我國擁有豐富的竹種資源,但是竹子遺傳育種研究基礎(chǔ)相對薄弱。部分原因是由于竹子具有特殊的開花習(xí)性,如開花周期長、時(shí)間不確定,并且大部分竹種開花后死亡,難以進(jìn)行品種選育和多世代的遺傳改良。剛竹屬植物系中國竹亞科中,經(jīng)濟(jì)價(jià)值最大,種類眾多的1屬,毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière)J.Houz.)是剛竹屬(Phyllostachys)在中國栽培歷史悠久、面積分布最廣的竹種,選擇毛竹這一典型的剛竹屬竹種作為研究對象,研究其開花的遺傳和分子調(diào)控機(jī)理,具有較高的理論研究意義和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。MADS-box基因家族是植物體內(nèi)的重要轉(zhuǎn)錄因子,它們中的很多成員廣泛參與植物成花調(diào)控和花器官發(fā)育,但是在毛竹中MADS-box基因家族中各成員參與開花調(diào)控的機(jī)制尚不明確,需要開展系統(tǒng)研究。近年來,隨著毛竹全基因組測序草圖的完成,在毛竹基因組水平上對MADS-box家族成員進(jìn)行功能研究具備了序列分析基礎(chǔ)。因此本研究通過對毛竹開花相關(guān)的PeMADS進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析和關(guān)鍵基因的克隆及功能研究,為探索竹子的成花機(jī)理提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:利用生物信息學(xué)技術(shù)搜索和鑒定毛竹MADS-box基因,在毛竹基因組中共發(fā)現(xiàn)42個MADS-box基因。由于毛竹基因組序列存在較大誤差,初步鑒定到的大量毛竹MADS-box基因中存在缺少關(guān)鍵保守結(jié)構(gòu)域和序列錯誤的情況。首先利用轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)對毛竹MADS-box基因序列進(jìn)行補(bǔ)齊和矯正,最終獲得序列較為完整準(zhǔn)確的PeMADS基因家族各成員序列。通過系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析對毛竹MADS-box基因進(jìn)行了分類,并結(jié)合其與水稻、擬南芥等模式植物的同源基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析。研究發(fā)現(xiàn)毛竹II型MADS-box基因的數(shù)目及分組與模式植物具有高度相似性,但I(xiàn)型MADS-box可能在毛竹基因組進(jìn)化過程中經(jīng)歷了大量的丟失事件,推測毛竹I型基因的進(jìn)化模式不同于其他物種及II型基因,具有更高的出生率-死亡率。通過對毛竹花序不同發(fā)育時(shí)期和不開花毛竹竹葉MADS-box基因家族成員的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),大量MADS-box基因參與到花序發(fā)育過程中,并與水稻同源基因具有相似的表達(dá)模式,這說明毛竹MADS-box基因在開花過程中起到關(guān)鍵作用,該分析同時(shí)對下一步開花相關(guān)的MADS-box基因家族成員的克隆和功能分析提供了重要的候選基因。從毛竹中克隆到24個MADS-box全長基因,序列比對分析表明這24個基因分別屬于不同的亞組,其中SQUA-,AG-和SVP-like亞組的PeMADS基因成員最多。通過對毛竹開花過程中基因表達(dá)分析和查閱文獻(xiàn)資料,選取9個PeMADS基因在擬南芥中異源超表達(dá),其中4個轉(zhuǎn)基因株系具有較為明顯的表型變化:PeMADS3,5,19和29的轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花;PeMADS3和PeMADS5轉(zhuǎn)基因植株具有花器官發(fā)育異常的表型。以上結(jié)果說明這4個PeMADS基因可能在竹子開花中所起重要的作用,為下一步的研究打下了基礎(chǔ)。PeMADS3和PeMADS5參與成花過程信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能初探。首先,對35S::PeMADS5轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行RT-qPCR檢測開花相關(guān)基因的表達(dá)研究表明,轉(zhuǎn)基因擬南芥的蓮座葉和花序中,AGL24和SOC1表達(dá)量顯著高于野生型擬南芥,AP1表達(dá)量下調(diào)。推測PeMADS5通過間接調(diào)控?cái)M南芥開花相關(guān)基因的表達(dá)情況來影響擬南芥開花時(shí)間及花器官發(fā)育。35S::PeMADS5過表達(dá)svp-31突變體(早花)的表型分析中,過表達(dá)植株和突變體開花時(shí)間沒有顯著變化,同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株花器官發(fā)育產(chǎn)生具有葉片狀宿存的萼片,這說明PeMADS5還能調(diào)控花器官發(fā)育。除雙子葉模式植物擬南芥外,還對PeMADS5進(jìn)行過表達(dá)轉(zhuǎn)化水稻試驗(yàn),共獲得10個轉(zhuǎn)基因株系,對其表型進(jìn)行持續(xù)觀察記錄。35S::PeMADS3轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行RT-qPCR表達(dá)分析,結(jié)果表明PeMADS3的過表達(dá)通過調(diào)控AP1,FUL和LFY基因的表達(dá)來影響花器官的發(fā)育。35S::PeMADS3過表達(dá)ap-1突變體,轉(zhuǎn)基因突變體花序變密,出現(xiàn)異位花器官。對PeMADS3進(jìn)行過表達(dá)轉(zhuǎn)化水稻試驗(yàn),共獲得12個轉(zhuǎn)基因株系,對其表型進(jìn)行持續(xù)觀察記錄。利用STRING軟件對毛竹MADS-box家族的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測,共鑒定到33個互作關(guān)系,包括34個PeMADS蛋白。為進(jìn)一步研究毛竹MADS-box家族成員之間的互作,分別構(gòu)建25個PeMADS的酵母雙雜交bait和prey載體,通過自激活檢測等方法驗(yàn)證所構(gòu)建的酵母表達(dá)載體無自激活性后,兩兩組合進(jìn)行篩選,共有67組PeMADS蛋白之間具有相互作用。利用Cytoscape軟件將酵母雙雜交統(tǒng)驗(yàn)證的蛋白互作結(jié)果構(gòu)建了毛竹MADS-box基因家族互作網(wǎng)絡(luò),為進(jìn)一步了解毛竹PeMADS基因功能提供了指導(dǎo)。
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S795.7
【圖文】：

[36]。如圖 1.1，植物 I 型 MADS-box 基因通常只含有守的 SRF-like MADS 域，沒有 K 域，在擬南芥中，質(zhì)：Mα、Mβ 和 Mγ 型[37]。 MIKC 這一命名源于結(jié)構(gòu)域：MADS 域（MADS-box）、I 區(qū)（Intervening端（C terminal）[38]。植物 MIKC 型蛋白又分為 M于 K 域和 I 區(qū)的長度，MIKCc型蛋白的 I 區(qū)通常較短C*型蛋白具有 4-5 個外顯子編碼的較長的 I 區(qū)， M型蛋白短[35, 39]。根據(jù) Becker 等對被子植物中主要 M果可將其分為 12 個亞家族，分別為：AG、AGL2/SEPL17、FLC、GGM13、STMADS11、AP1/SQUA、A分為 P 類和 S 類，目前，擬南芥中鑒定到的 P 類 MIKGL94，S 類蛋白有 AGL66、AGL67 和 AGL104[40]。M究最為透徹的 MADS-box 類型，相比之下，I 型 MA鮮少報(bào)道，少數(shù)研究證明其在植物雌雄配子體的發(fā)育

1 文獻(xiàn)綜述因家族[54]。除了提供花的同源功能外，MADS-box 基因在調(diào)控開花植物生殖發(fā)育因網(wǎng)絡(luò)中還有許多其他功能[54, 55]。一些 MADS-box 是 開花時(shí)間基因 ，在植物年日照長度和春化等內(nèi)部及外部環(huán)境因素的影響下，抑制或促進(jìn)成花轉(zhuǎn)化[56MADS-box 基因也參與了花受精后種子和果實(shí)的發(fā)育。例如，AGL8/FUL 編碼了芥果實(shí)分裂區(qū)正常發(fā)育所需的蛋白質(zhì)[58]；SHP1 和 SHP2 基因參與了角果形態(tài)建程中細(xì)胞分裂、擴(kuò)張和分化等過程[59]。此外，MADS-box 基因家族成員在營養(yǎng)發(fā)程中也發(fā)揮調(diào)控作用，如在胚胎、根或葉中表達(dá)的 AGL12、AGL19 和 ANR1、AGAGL3[31]。隨著裸子、蕨類和蘚類植物中 MADS-box 基因的深入研究，進(jìn)一步證這些基因在植物中的作用并不局限于花或果實(shí)的發(fā)育[60-62]。

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本文編號：2715425