【摘要】：林木在多年生的次生生長過程中,會(huì)受到各種不同的外界環(huán)境條件的制約。其中,干旱是重要環(huán)境限制因子之一,對(duì)林業(yè)生產(chǎn)和自然生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成全球性威脅,嚴(yán)重影響森林生物量與生產(chǎn)力。轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾在調(diào)節(jié)植物適應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用,但是二者之間如何相互協(xié)調(diào)控制耐旱基因表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。林木主要利用木質(zhì)部將從土壤中吸收的水分運(yùn)輸?shù)降厣喜糠值娜~等器官。木質(zhì)部是研究樹木次生生長適應(yīng)干旱脅迫的獨(dú)特生物系統(tǒng)。因此,本研究以毛果楊(Populustrichocarpa)的木質(zhì)部為對(duì)象,開展了 AREB1轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白乙酰化修飾協(xié)同控制耐旱基因表達(dá)分子機(jī)制的研究。采用染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合高通量測(cè)序(ChIP-seq)和轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)分別測(cè)定了毛果楊木質(zhì)部在干旱脅迫下的組蛋白3第9位賴氨酸乙�；揎�(H3K9ac)圖譜和轉(zhuǎn)錄組。整合分析ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)干旱脅迫后H3K9ac水平顯著增加的基因,轉(zhuǎn)錄被激活;H3K9ac水平下降的基因,轉(zhuǎn)錄被抑制,表明H3K9ac組蛋白修飾參與調(diào)控楊樹應(yīng)答干旱脅迫的基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件富集分析發(fā)現(xiàn),AREB1(ABA-Responsive Element Binding 1)蛋白結(jié)合的 ABRE(ABA-Responsive Element)元件在H3K9ac修飾發(fā)生改變的干旱脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子上發(fā)生明顯的富集,表明ABRE元件可能介導(dǎo)H3K9ac修飾對(duì)這些基因的調(diào)控。本研究鑒定出了76個(gè)H3K9ac修飾發(fā)生改變且含有ABRE元件的干旱脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因,由其中選了三個(gè)基因(PtrNAC006、PtrNAC007、PtrNAC120),并獲得了它們的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛果楊。表型分析顯示,過量表達(dá)PtrNAC基因降低毛果楊木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)腔孔徑,增加木質(zhì)部導(dǎo)管數(shù)量,并且增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株耐旱能力,推測(cè)PtrNAC基因可能通過影響次生木質(zhì)部發(fā)育,改變導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)和數(shù)量,從而使楊樹次生生長適應(yīng)干旱脅迫。ChIP-seq和ChIP-qPCR結(jié)果顯示,隨著干旱程度的逐漸增加Ptr 基因啟動(dòng)子上ABRE元件區(qū)域的H3K9ac富集水平增加,表明ABRE元件參與H3K9ac調(diào)控PtrNAC基因?qū)Ω珊得{迫的應(yīng)答。RNA-seq與RT-qPCR結(jié)果顯示,AREB1轉(zhuǎn)錄因子基因與組蛋白乙�；笍�(fù)合體基因 GCN5(GENERAL CONTROL tNON-DEREPRESSIBLE 5)、ADA2b(ALTERATION/DEFICIENCY IN ACTIVATION 2)受干旱脅迫誘導(dǎo)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。Pull-down體外實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AREB1、GCN5、ADA2b蛋白之間相互作用形成蛋白三聚體。獲得了 PtrGCN5-1、PtrAREB1-2的抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛果楊植株及PtrADA2b-3的CRISPR突變體植株。ChIP-qPCR與RT-qPCR分析顯示,轉(zhuǎn)基因毛果楊及突變體植株干旱脅迫后,H3K9ac、RNA聚合酶Ⅱ的富集水平和PtNAC基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降,并且轉(zhuǎn)基因植株與突變體耐旱性降低。此外,前期研究結(jié)果顯示AREB1轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合ABRE順式作用元件并上調(diào)PtrNAC基因表達(dá)。綜合以上結(jié)果,表明轉(zhuǎn)錄因子AREB1通過與GCN5、ADA2b相互作用將組蛋白乙�；笍�(fù)合體招募到PtrNAC啟動(dòng)子上,引起PtrNAC基因H3K9乙�；せ钇浔磉_(dá),從而啟動(dòng)PtrNAC介導(dǎo)的抗旱基因網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)楊樹適應(yīng)干旱脅迫。綜上所述,本研究明確了毛果楊中轉(zhuǎn)錄因子AREB1和組蛋白乙�；笍�(fù)合體GCN5-ADA2b之間的相互作用關(guān)系及其對(duì)共同靶基因的調(diào)控作用,揭示了轉(zhuǎn)錄因子與表觀遺傳修飾協(xié)同調(diào)控楊樹次生生長適應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制,為利用分子育種技術(shù)進(jìn)行林木高抗育種提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１－１技術(shù)路線逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋１－１邋Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ邋ｒｏｕｔｅ逡逑

迫影響下Ｈ３Ｋ９ａｃ差異結(jié)合的基因。首先，對(duì)３個(gè)月的毛果楊溫室苗進(jìn)行了干旱脅迫的逡逑處理，然后在同一時(shí)間點(diǎn)分別收集了正常澆水（ＮＤ）、干旱脅迫５天（Ｄ５）、干旱脅迫逡逑７天（Ｄ７）的次生木質(zhì)部材料（圖２－３）。參照Ｌｉ等在２０１４年的報(bào)道，利用ＣｈＩＰ－ｓｅｑ體逡逑系，測(cè)定了不同干旱時(shí)間點(diǎn)的Ｈ３Ｋ９ａｃ圖譜（圖２－４）邋［７５，７６］。利用ｄｉｆｉＲｅｐｓ方式鑒定了逡逑干旱５天（Ｄ５／ＮＤ）和７天（Ｄ７／ＮＤ）的Ｈ３Ｋ９ａｃ差異修飾的基因組位點(diǎn)。其中，干旱逡逑５天有４５７８?jìng)�(gè)Ｈ３Ｋ９ａｃ修飾水平上升位點(diǎn)、５０８１個(gè)Ｈ３Ｋ９ａｃ修飾水平下降位點(diǎn)，差異富逡逑集位點(diǎn)共１０５５９個(gè)；干旱７天有５５３０個(gè)Ｈ３Ｋ９ａｃ修飾水平上升位點(diǎn)、５３９９個(gè)Ｈ３Ｋ９ａｃ逡逑修飾水平下降位點(diǎn)，差異修飾位點(diǎn)共１２０３６個(gè)（Ｐ－ａｄｊ＜０．０５）（表２－１）。己有的研究報(bào)道逡逑表明，Ｈ３Ｋ９ａｃ的修飾參與調(diào)控苔蘚植物小立碗蘚（／７＾５＾0？？／的／／＜３邐和擬南芥應(yīng)逡逑答干旱脅迫［３９，４７］。毛果楊的ＣｈＩＰ－ｓｅｑ結(jié)果也表明，干旱脅迫后，許多基因的Ｈ３Ｋ９ａｃ修逡逑飾水平均發(fā)生了變化。所以，，Ｈ３Ｋ９ａｃ的修飾很可能也參與調(diào)控毛果楊對(duì)干旱脅迫的應(yīng)逡逑答過程。逡逑－１７－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S792.11

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本文編號(hào)：2711262