【摘要】：沙棗(Elaeagnus angustifolia),是胡頹子科胡頹子屬落葉喬木。沙棗常常作為防風(fēng)固沙和城市建設(shè)的綠化樹種,具有很高的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。特別是作為耐鹽堿植物,在鹽堿地修復(fù)方面有著重要的作用。在前期研究中發(fā)現(xiàn),沙棗的根際既存在結(jié)瘤放線菌又存在叢枝菌根真菌(AMF)。而目前對(duì)于沙棗、AMF和結(jié)瘤放線菌這種三位一體的共生關(guān)系研究很少。本研究對(duì)黑龍江省肇東市引種沙棗試驗(yàn)田進(jìn)行沙棗根際微生物多樣性和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行研究,并分離培養(yǎng)能夠固氮結(jié)瘤的放線菌和沙棗根際優(yōu)勢(shì)AMF菌株,將其接種于沙棗幼苗根際,并做鹽脅迫處理,結(jié)合分子和理化性質(zhì)檢測(cè)方法,針對(duì)AMF和固氮放線菌對(duì)沙棗的生理和分子響應(yīng)進(jìn)行研究,旨在揭示接種AMF和放線菌促進(jìn)沙棗耐鹽堿的作用機(jī)制,具有一定的創(chuàng)新意義。主要研究結(jié)果如下:1.通過對(duì)沙棗種植地三種不同栽種期的沙棗根和根際土壤取樣,測(cè)定其根際菌根侵染率和放線菌數(shù)量。明確了沙棗根際的土壤理化指標(biāo)存在著顯著差異,隨著年份的增長,速效磷、全氮、土壤含水量、放線菌數(shù)量和AMF孢子數(shù)量顯著增加,pH值和電導(dǎo)率顯著降低。通過這些指標(biāo)與沙棗根際土壤微生物數(shù)量指標(biāo)做相關(guān)性分析可知,這種變化與沙棗根際微生物存在密切的相關(guān)性,并且研究發(fā)現(xiàn)放線菌數(shù)量與AMF孢子密度也呈顯著正相關(guān),進(jìn)一步證明了沙棗根系放線菌和AMF能夠與沙棗形成共生關(guān)系,從而改善沙棗根際土壤的肥力,達(dá)到土壤修復(fù)的目的。2.用蔗糖濕篩離心法分離AMF孢子,計(jì)算物種相對(duì)多度和分離頻度,根據(jù)AMF孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定,對(duì)LSU-ITS-SSU區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并分子鑒定,獲得了 5種AMF與沙棗植株共生,分別為縮隔球囊霉(Septoglomus constrictum)、聚叢球囊霉(Rihizophagus aggregatum)、根內(nèi)球囊霉(Rhizophagus intraraices)、蘇格蘭管柄囊霉(Funneliforrmis caledonius)、摩西管柄囊霉(Funneliforrmis mosseae),其中R.intraradices 為優(yōu)勢(shì)菌。3.對(duì)沙棗根際土壤和根瘤中的放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng),分離得到沙棗根際的放線菌有6科10屬127種。利用無氮培養(yǎng)基對(duì)127株菌進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)能在無氮培養(yǎng)基上生長的菌株有80株。提取80株菌的基因組,針對(duì)nifH和nodA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中具有固氮功能的放線菌有22株。利用16srRNA進(jìn)行分子鑒定,22株菌中鑒定出7株菌,分別為堆孢鏈霉菌(Streptomyces massasporeus)、綠青鏈霉菌(Streptomyces iakyrus)、瘡痂病鏈霉菌(Streptomyces scabies)、林肯鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis)、維及尼鏈霉菌(Sreptomyces virginiae)、暗黑橄欖鏈霉菌(Streptomyces olivoviridis)和Streptomyces pratensis。其中只有Streptomyces pratensis 既有nifH基因又有nodA基因。4.將篩選出的叢枝菌根真菌Rhizophagus intraradices(R.i.)和放線菌Streptomyces pratensis(S.p.),單接種和雙接種在盆栽沙棗幼苗上,在300mM NaCl濃度下鹽處理30d后,用光合儀測(cè)定沙棗幼苗的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在受到鹽脅迫時(shí),雙接種處理能夠有效的提高沙棗幼苗的光合速率,降低氣孔導(dǎo)度,減少蒸騰率。5.測(cè)定了盆栽沙棗幼苗植株的基莖、株高和干重等地上生長指標(biāo),以及根長、根投影面積、根面積和根體積等地下根形態(tài)。結(jié)果表明,在加鹽條件下,除了 R.i處理的根體積大于其他處理外,其他指標(biāo)都顯示為R.i.+S.p.處理R.i.或S.p.處理CK處理。受到鹽脅迫時(shí),雙接種R.i.+S.p.處理能夠顯著提高植株的生物量。6.開展了沙棗根際土壤過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性。無論是鹽處理還是未加鹽處理?xiàng)l件下,R.i.+S.p.處理幼苗根際土壤的酶活性都大于其他處理。在鹽處理?xiàng)l件下,單接S.p.處理的脲酶活性大于R.i.處理的酶活性,而其他酶活均相反。雙接種R.i.+S.p.能夠有效提高沙棗幼苗的土壤酶活,單接S.p.處理比單接R.i.能夠提高土壤脲酶活性的酶活。7.測(cè)定了沙棗葉片中PRO和MDA的含量及CAT、SOD和POD酶活性。加鹽條件下,雙接種R.i.+S.p.顯著提高幼苗SOD、POD、CAT活性和PRO含量,并能有效降低MDA的含量。而單接R.i.的沙棗幼苗酶活性高于單接S.p.處理,單接S.p.的幼苗MDA含量高于單接R.i.處理。在鹽脅迫條件下,雙接種R.i.+S.p.處理能夠有效提高沙棗植株氧化酶活性,提高脯氨酸含量,有效降低丙二醛含量,促使植物能夠正常生長,而單接種放線菌的效果沒有單接種AMF的效果好。8.利用火焰吸收法測(cè)定了 Na+、K+離子含量,并計(jì)算K+/Na+比值。在鹽處理?xiàng)l件下,CK處理的幼苗Na+濃度最高,雙接種R.i.+S.p.的幼苗Na+濃度最低。K+濃度和K+/Na+比率均為雙接種處理最高,單接種處理最低。由此可見,鹽脅迫下,雙接種R.i.+S.p.于沙棗幼苗上能夠有效的降低葉片中的Na+濃度,提高K+/Na+比值。9.測(cè)定不同處理沙棗幼苗的菌根侵染率和放線菌結(jié)瘤率,在鹽脅迫下單接種R.i.菌根侵染率為50.67%,接種R.i.+S.p.菌根侵染率為54.67。在不加鹽的處理中接種R.i.菌根侵染率為70.67%,接種R.i.+S.p.菌根侵染率為77.33%。沙棗根際結(jié)瘤率分別為7、8、7.67、9.33、13.33。AMF的侵染率與株高存在顯著的正相關(guān)性,結(jié)瘤率與鉀離子含量存在正相關(guān)性。進(jìn)一步證明AMF對(duì)提高沙棗植株生物量起著重要作用。10.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究沙棗葉片脯氨酸合成酶相關(guān)基因P5CS相對(duì)表達(dá)量和放線菌固氮酶相關(guān)基因nifH的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在轉(zhuǎn)錄水平上均為上調(diào)反應(yīng),且雙接種R.i.+S.p.處理的相對(duì)表達(dá)量均高于單接種處理。P5CS基因的表達(dá)量與脯氨酸含量呈正相關(guān)。nifH基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)與根際土壤中脲酶活性存在負(fù)相關(guān)。11.利用宏基因組測(cè)序的方法探究鹽脅迫下接種R.i.和固氮放線菌S.p.處理的沙棗根際微生物群落組成和代謝通路相關(guān)基因。研究結(jié)果表明:共得到7932666條ORFs,平均每個(gè)樣品881407條ORFs;GC含量為62.69%,完整基因有973472個(gè),占所有非冗余基因總數(shù)的17.87%。主要的微生物菌門分為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanbactiria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和綠菌門(Chlorobi)。主要包括的代謝通路全通路(新陳代謝通路、次生代謝產(chǎn)物的合成、抗生素生物合成、碳代謝、2-氧代羧酸代謝、脂代謝、氨基酸合成和芳香族化合物的降解)、碳水化合物代謝通路、氨基酸代謝、輔因子和維他命代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)有著密切關(guān)系。其中在鹽脅迫下主動(dòng)防御的代謝通路為膜轉(zhuǎn)運(yùn),被動(dòng)防御的代謝通路有碳水化合物代謝通路、氨基酸代謝通路、輔因子和維他命代謝通路。在鹽脅迫條件下,接種AM真菌和放線菌會(huì)明顯改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能,使得土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,并且結(jié)構(gòu)和功能的變化規(guī)律是一致的,而且添加AM真菌和放線菌會(huì)抵消鹽處理對(duì)沙棗土壤根際土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的影響,增強(qiáng)沙棗對(duì)鹽脅迫的抗性。隨著沙棗栽植年份的增加,其修復(fù)鹽堿土壤的效果越明顯。使沙棗起到修復(fù)鹽堿地的作用因素是沙棗根際的AMF和能夠與其形成根瘤的放線菌。在鹽脅迫條件下,兩種微生物協(xié)同作用能夠提高沙棗植株光合作用、生物量、土壤酶活性和抗鹽堿相關(guān)酶的活性。本文研究成果為鹽堿地的生態(tài)治理提供了理論依據(jù),為沙棗的菌根化培育奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

與Ｐ亞基形成一個(gè)ａ２Ｐ２四聚體，并且其包含了邋ＦｅＭｏ－ｃｏ邋（底物還原位點(diǎn)）。是鉬鐵逡逑蛋白的Ｐ亞基。在ａ亞基與Ｐ亞基的交界面處形成Ｐ－ｄｕｓｔｅｒ［４８］。研究者們初步的檢測(cè)出逡逑放線菌的結(jié)構(gòu)基因組成如圖１．１［４９］。逡逑－４－逡逑

１－３：邋Ｔｈｅ邋ｆｏｒｍ邋ｏｆ邋ＡＭＦ邋ｖｅｓｉｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ邋４０邋ｔｉｍｅｓ邋ｍｉｒｒｏｒ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋４－５：邋Ｔｈｅ邋ｆｏｒｍ邋ｏｆ邋ＡＭＦ邋ｖｅｓｉｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ逡逑１０邋ｔｉｍｅｓ邋ｍｉｒｒｏｒ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；邋６：邋Ｔｈｅ邋ｆｏｒｍｓ邋ｏｆ邋ＡＭＦ邋ｈｙｐｈａｅ邋ｕｎｄｅｒ邋２０邋ｔｉｍｅｓ邋ｍｉｒｒｏｒ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．逡逑沙棗菌根侵染率方差分析結(jié)果如圖２－２，栽種１年的沙棗ＡＭＦ侵染率與栽種２年和逡逑３年沙棗的侵染率存在著顯著差異（ｐ＜０．０５）。栽種１－３年的沙棗ＡＭＦ侵染率分別為逡逑８１％，８９％和９１％。隨著年份的增長ＡＭＦ對(duì)沙棗的侵染在不斷的增加，，在栽種３年的逡逑沙棗ＡＭＦ侵染率達(dá)到所測(cè)栽種年限的最大值。逡逑沙棗根際土壤中ＡＭＦ孢子數(shù)量的方差分析結(jié)果如圖２－３。栽種１－３年的沙棗根際土逡逑壤中ＡＭＦ孢子密度分別為９６，邋１２８．６７，邋１５２．６７，他們之間存在顯著差異（ｐ＜０．０５）。隨逡逑著沙棗種植時(shí)間的增加，其根際土壤中ＡＭＦ的孢子密度也隨之增長，栽種３年時(shí)達(dá)到逡逑測(cè)定年限的最大值。逡逑Ｄ．９２邋－邐ｂ逡逑°＇９邋Ｉ邐N逡逑Ｄ．３８邋：逡逑＾邋３．３４逡逑！邋ｍ邐ａ逡逑ｓ邋３－３２邋：邐Ｔ逡逑＜邋１逡逑０．８邋ｉ邐１邋■，：．逡逑０．７８逡逑０．７６邋＜逡逑＾邋７４邋邋邋邋．邋邋．．．”邋邋逡逑１年邐２年邐３年逡逑圖２－２邋ＡＭＦ的侵染率逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－２邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｏｆ邋ＡＭＦ逡逑－２２－逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S793.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2709538