【摘要】：低溫脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要非生物脅迫之一,而植物體本身在適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程,形成了一系列應(yīng)對(duì)外界不良環(huán)境的應(yīng)答機(jī)制,其中,CBF低溫信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子途徑在植物的抗寒過(guò)程起到舉足輕重的作用。香樟(Cinnamomum camphora L.)喜溫暖濕潤(rùn)氣候,其對(duì)低溫的適應(yīng)能力較低,一般溫度低于10℃時(shí)生長(zhǎng)受到抑制,5℃停止生長(zhǎng),0℃冰點(diǎn)時(shí)易引起凍害。樹(shù)體生長(zhǎng)時(shí)可忍耐短期的零下10℃左右的溫度,長(zhǎng)時(shí)間處于低溫易引起落葉甚至樹(shù)體死亡。而我國(guó)北方的冬天漫長(zhǎng)而寒冷,嚴(yán)重限制了其在北方地區(qū)的推廣和園林應(yīng)用。本研究在實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)香樟CcCBFs(CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd)的研究基礎(chǔ)上,以野生型、T2代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥和T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥為材料,檢測(cè)低溫脅迫下(4℃)T2代和T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥各項(xiàng)生理、生化指標(biāo);利用-4℃模擬凍害,檢測(cè)T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥的抗凍性;并利用q-PCR檢測(cè)低溫脅迫6 d時(shí)T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥抗氧化基因以及晚期胚胎豐富基因的表達(dá)水平。從上述生理指標(biāo)和抗逆相關(guān)基因表達(dá)水平中篩選出最優(yōu)增強(qiáng)擬南芥抗寒性的CcCBFc基因。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析研究差異表達(dá)基因,從中確定CcCBFc基因調(diào)控的下游抗寒基因,并推測(cè)CcCBFc基因的功能。本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄組分析,揭示CcCBFc基因在擬南芥中發(fā)揮的抗寒作用的機(jī)理,推測(cè)該基因在擬南芥抵御低溫脅迫的生物學(xué)功能。本研究的主要結(jié)果如下:1.對(duì)T2代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥抗寒生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析,結(jié)果表明,在低溫脅迫處理72 h,轉(zhuǎn)香樟CcCBFa和CcCBFc擬南芥超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量顯著高于野生型,且高于轉(zhuǎn)香樟CcCBFb和CcCBFd擬南芥;丙二醛含量顯著低于野生型且較轉(zhuǎn)香樟CcCBFb和CcCBFd基因低�？梢�(jiàn),CcCBFa和CcCBFc基因可有效增強(qiáng)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性。2.對(duì)T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥抗寒生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析,結(jié)果表明,在低溫脅迫處理6 d,轉(zhuǎn)香樟CcCBFc的擬南芥過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性和脯氨酸的含量顯著高于野生型,且高于其它3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥;丙二醛含量顯著低于野生型,且低于其它3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥。即CcCBFc基因可明顯地提高T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒能力。3.利用-4℃模擬凍害,觀察T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥的表型。結(jié)果顯示,在-4℃處理14 d后,可觀察到,野生型擬南芥葉片明顯面積減小和萎蔫,植物組織死亡,轉(zhuǎn)香樟CcCBFa、CcCBFb和CcCBFd基因擬南芥葉片呈現(xiàn)不同程度的葉片面積減小和萎蔫,而轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥葉片則正常伸展。可見(jiàn),CcCBFc基因?qū)3代轉(zhuǎn)基因擬南芥抗凍性的提高同樣具有一定的積極作用。4.通過(guò)q-PCR檢測(cè)低溫脅迫6 d后T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥抗氧化酶基因以及晚期胚胎豐富基因的表達(dá)量,其結(jié)果顯示,外源CcCBFc和CcCBFa基因都可在轉(zhuǎn)基因擬南芥中上調(diào)過(guò)氧化物酶基因、超氧化物歧化酶基因、抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因和晚期胚胎豐富蛋白基因的表達(dá)水平,從而提高T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫的抵抗能力。5.對(duì)T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果表明,未低溫脅迫時(shí),轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因和野生型擬南芥間植株差異表達(dá)基因?yàn)?335個(gè),1284個(gè)表達(dá)上調(diào),其中504個(gè)表達(dá)顯著上調(diào);低溫脅迫下,轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因和野生型擬南芥間植株差異表達(dá)基因?yàn)?125個(gè),364個(gè)表達(dá)上調(diào),其中152個(gè)表達(dá)顯著上調(diào);對(duì)152個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的基因進(jìn)行檢索,獲得51個(gè)與抗寒有關(guān)的基因。6.對(duì)低溫脅迫下T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因和野生型擬南芥間152個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的基因檢索,發(fā)現(xiàn)AP2/ERF、MYB、bHLH、bZIP、Zinc-finger和WRKY等6類(lèi)與抗寒相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥抗寒過(guò)程,其中在未低溫處理時(shí)的轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥中,Zinc-finger家族的AT1G30135基因和MYB家族的AT1G18330基因能夠被檢測(cè)表達(dá),這兩個(gè)基因在低溫脅迫下分別參與茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)通路和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路。故推測(cè)外源CcCBFc基因可能通過(guò)調(diào)控AT1G30135和AT1G18330的組成型表達(dá),參與茉莉酸和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)茉莉酸和乙烯的合成,從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性。7.對(duì)低溫脅迫下的T3代轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因和野生型擬南芥間51個(gè)與抗寒相關(guān)的差異基因分析中,檢索出26個(gè)熱休克相關(guān)的基因,推測(cè)這26個(gè)熱休克相關(guān)的基因可能與抗寒相關(guān);其中在未低溫處理時(shí)的轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥中有20個(gè)熱休克相關(guān)基因能夠被檢測(cè)表達(dá),對(duì)差異基因聚類(lèi)分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)香樟CcCBFc基因擬南芥熱休克相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量較野生型高,推測(cè)CcCBFc基因可上調(diào)熱休克相關(guān)基因的表達(dá)水平,最終發(fā)揮抗寒的功能。
【圖文】：

轉(zhuǎn)香樟 CcCBFs 基因擬南芥抗寒性分析及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序根據(jù)擬南芥響應(yīng)低溫信號(hào)通路的特點(diǎn)，滕進(jìn)婧[74]等人將金柑 MLP2-1 南芥，并對(duì)低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，根據(jù)差異基因 K徑推測(cè)金柑 MLP2-1 基因可能參與調(diào)節(jié)植物激素與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑，因擬南芥的抗凍性。由此可見(jiàn)，對(duì)擬南芥低溫信號(hào)通路的了解是探討外控轉(zhuǎn)基因擬南芥抗寒性關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

轉(zhuǎn)香樟 CcCBFs 基因擬南芥抗寒性分析及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序3.1.2 T3 代轉(zhuǎn)香樟 CcCBFs 基因擬南芥的獲得與鑒定利用植物葉片直接 PCR 試劑盒，分別使用特定引物進(jìn)行野生型和 T3 代轉(zhuǎn)香樟CcCBFs 基因擬南芥目的基因片段的擴(kuò)增，結(jié)果如圖所示：對(duì)照野生型均無(wú)條帶擴(kuò)出轉(zhuǎn)香樟 CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc 和 CcCBFd 基因的擬南芥則分別擴(kuò)增出相應(yīng)目的基因條帶，，擴(kuò)增條帶均單一且未出現(xiàn)雜帶和引物二聚體，初步判斷目的基因已整合進(jìn)入各自擬南芥基因組，每個(gè)基因分別獲得 4~5 株不等的轉(zhuǎn)基因株系。
【學(xué)位授予單位】：南陽(yáng)師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S792.23

【相似文獻(xiàn)】

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1 王建格;轉(zhuǎn)香樟CcCBFs基因擬南芥抗寒性分析及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[D];南陽(yáng)師范學(xué)院;2019年

2 張佳佳;香樟CcCBFs基因的表達(dá)分析及在模式植物中的功能驗(yàn)證[D];南陽(yáng)師范學(xué)院;2018年

本文編號(hào)：2690458