【摘要】：星天牛Anoplophora chinensis(Forster)是東南沿海木麻黃防護(hù)林的主要蛀干害蟲,屬全國林業(yè)危險性有害生物。其寄主廣泛,以幼蟲蛀食近地的主干或主根,破壞樹體養(yǎng)分和水分的運輸,導(dǎo)致樹勢衰弱,重者整株枯死。該蟲在福建木麻黃沿海防護(hù)林中大面積發(fā)生,一般林分有蟲株率為20~30%,危害嚴(yán)重的高達(dá)80%以上,大大削弱了防護(hù)林的防護(hù)效能。以往星天牛的防治主要是化學(xué)藥劑防治為主,由于天牛成蟲的羽化期較長、幼蟲危害隱蔽,化學(xué)藥劑難以長時間控制,防治效果不甚理想。綠僵菌Metarhizium spp.是應(yīng)用最為廣泛的殺蟲真菌之一,由于具有良好的傳播效果、較長的林間宿存能力、不易導(dǎo)致害蟲抗性以及容易生產(chǎn)等優(yōu)點,在農(nóng)林害蟲的防治中發(fā)揮了重要作用。本文通過星天牛幼蟲人工飼養(yǎng)、星天牛高致病力菌株篩選及評價、綠僵菌培養(yǎng)及林間應(yīng)用等方面的系統(tǒng)研究,為利用綠僵菌防治木麻黃沿海防護(hù)林星天牛危害提供技術(shù)依據(jù),同時應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)對星天牛幼蟲感染綠僵菌后的免疫響應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行了分析。本文主要結(jié)果如下:1、通過3年、4種不同配方人工飼料星天牛連續(xù)繼代飼養(yǎng),比較人工飼料配方和溫度條件對飼養(yǎng)效果的影響,結(jié)果表明:星天牛在4種不同配方的人工飼料上均可完成生活史,飼養(yǎng)出成蟲能正常交配產(chǎn)卵,孵化的幼蟲能在人工飼料上繼續(xù)完成發(fā)育;但化蛹率、羽化率在不同飼料上差異顯著,以含有木麻黃鋸屑和麥麩的Diet A和Diet D飼養(yǎng)效果較好。應(yīng)用Diet A飼養(yǎng),第1、2、3代(持續(xù)3年)幼蟲化蛹率分別為100%、90%和95%,蛹羽化率分別為100%、83%和90%;應(yīng)用Diet D,第1、2、3代化蛹率分別為87%、78%和87%,羽化率分別為87%,67%和80%,而Diet B和C上飼養(yǎng)的幼蟲化蛹率和羽化率較低。室溫下飼養(yǎng)的化蛹率和羽化率較恒溫條件(25℃和28℃)下高,且化蛹和羽化時間較整齊(均在4~5月,與林間觀察一致),說明變溫對星天牛化蛹時間有顯著影響,在發(fā)育過程中低溫的存在顯著提高了星天牛幼蟲的化蛹率和促進(jìn)化蛹、羽化的一致性。2、金龜子綠僵菌不同菌株菌落生長速度、產(chǎn)孢量及其對星天牛的致病力測定表明:不同菌株生長速率和產(chǎn)孢量間存在顯著差異,MaZPTR-01菌株生長速度較快、產(chǎn)孢量較高,在PPDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d后菌落直徑達(dá)5.9 cm,產(chǎn)孢量為1.1×108孢子/cm2。不同綠僵菌菌株對星天牛幼蟲的致病力也存在顯著差異,接種20 d后,星天牛幼蟲累積死亡率在40%~96.7%之間;MaZPTR-01菌株對星天牛幼蟲致死速度快,致死率達(dá)到96.7%,僵蟲率達(dá)到86.7%,顯著較其它菌株高,致死中時(LT50)為5.71 d,顯著較其它菌株短。此菌株可作為優(yōu)良菌株用于星天牛的防治。3、運用時間-劑量-死亡率模型分析了綠僵菌MaZPTR-01菌株對星天牛幼蟲的致病力,結(jié)果表明:使用不同濃度的孢子懸浮液接種,星天牛幼蟲死亡率隨著孢子濃度的增加和作用時間的延長而增大,1.0×109、1.0×108孢子/mL濃度的綠僵菌孢子懸浮液處理7 d和9 d后,幼蟲累積死亡率均達(dá)到100%;用1.0×107、1.0×106、1.0×105孢子/mL濃度處理15 d后,累積死亡率分別為93.3%、70.0%和56.7%。LD50和LD90隨接種處理后時間的增加而降低,劑量效應(yīng)逐漸增強。LT50隨處理的孢子懸浮液濃度增加而減小,時間效應(yīng)逐漸增強。不同齡期幼蟲接種處理后的死亡速度、LT50和LT90隨著齡期的增加而延長,初孵(1齡未取食幼蟲)、1齡、2齡、3齡、4齡幼蟲的LT50分別為2.46 d、4.53 d、4.39 d、5.82 d和8.92 d,綠僵菌對3齡以前的幼蟲致病力較強。4、對星天牛高致病力菌株MaZPTR-01的發(fā)酵條件研究表明:MaZPTR-01菌株的最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉1份、麥麩3份、米粉1份、谷殼3份(按體積份計)。固體培養(yǎng)基加水后滅菌的處理組,綠僵菌產(chǎn)孢量顯著高于先滅菌后加無菌水的處理組。每500g固體培養(yǎng)基加水400m L混合后滅菌處理,基質(zhì)的物理狀態(tài)好、產(chǎn)孢量最高。固體培養(yǎng)基厚度以5cm培養(yǎng)效率最好。應(yīng)用綠僵菌MaZPTR-01菌株相關(guān)菌劑進(jìn)行的林間防治試驗表明:林間星天牛成蟲接觸綠僵菌菌條13 d后,死亡率達(dá)100%,LT50為5.93 d,天牛成蟲平均存活期為7.1 d,顯著地低于對照的26.1 d,顯示菌條在林間對星天牛成蟲具有較高的侵染效率。幼蟲防治試驗表明,星天牛幼蟲蟲齡越小、蛀道越短,噴孢子懸浮液的防治效果越好,初孵幼蟲期進(jìn)行噴菌處理,木段中的幼蟲死亡率超過90%。使用綠僵菌菌條與噴菌液處理結(jié)合的方式進(jìn)行防治,木麻黃林分有蟲株率僅為5.3%,較對照組(38.9%)下降了86.3%,具有推廣應(yīng)用價值。5、通過RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對健康的(CK)及被綠僵菌MaZPTR-01菌株侵染12h(Ma12)、24h(Ma24)和36h(Ma36)的星天牛幼蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選了差異表達(dá)基因,并利用生物信息學(xué)工具對差異表達(dá)基因進(jìn)行了功能注釋、分類和參與的信號通路分析,結(jié)果表明:與de novo拼接獲得的星天牛基因組相比,Ma12樣本有3487個差異基因(上調(diào)基因有2284個,下調(diào)基因有1203個);Ma24有3476個差異基因(上調(diào)基因2265個,下調(diào)基因1211個);Ma36樣本差異基因有4440個(上調(diào)基因3067個,下調(diào)基因有1373個)。不同時段差異基因進(jìn)行了GO注釋分析發(fā)現(xiàn),Ma12共1756個差異基因(DEGs)富集在825個GO terms中,顯著性富集的terms15個;Ma24共1746個差異基因(DEGs)富集在858個GO terms中,顯著性富集的terms5個;而Ma36共2584個差異基因(DEGs)富集在1076個GO terms中,顯著性富集的terms22個。富集在昆蟲免疫相關(guān)terms中的基因多呈現(xiàn)上調(diào),在代謝有關(guān)terms中的基因多數(shù)下調(diào)。KEGG pathway分析結(jié)果顯示:Ma12、Ma24和Ma36共有41個顯著富集的pathway(Q-value≤0.05),3個時段均能顯著富集的pathway有溶酶體、長時程抑制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、谷胱甘肽代謝、其他多糖降解、戊糖和糖醛酸轉(zhuǎn)換、吞噬體、抗原加工遞呈等8個通路,富集在與免疫與疾病相關(guān)的通路中的差異基因表達(dá)多呈上調(diào),而與代謝相關(guān)通路中富集到的差異基因表達(dá)多呈下調(diào)。通過GO、KEGG分析篩選到一些免疫相關(guān)基因,包括模式識別受體如肽聚糖識別蛋白(PGRP)、β-1,3-葡聚糖識別蛋白(βGRP)、C型凝集素(CTLs)、清道夫受體(SCRs)等、與信號調(diào)節(jié)有關(guān)的基因如絲氨酸蛋白酶及其抑制劑等、與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因如Toll樣受體蛋白、cactus、背相互作用蛋白、spaetzle蛋白等Toll途徑中的關(guān)鍵蛋白,以及免疫效應(yīng)因子基因如酚氧化酶原激活因子及Hdd11、防御素、天蠶抗菌肽、鞘翅素等抗菌肽,這些基因表達(dá)在MaZPTR-01菌株侵染后顯著上調(diào),表明酚氧化酶原級聯(lián)反應(yīng)和Toll途徑控制的抗菌肽表達(dá)可能在幼蟲早期免疫中發(fā)揮了重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S763.306.4

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