【摘要】：微衛(wèi)星(SSR)具有共顯性、多態(tài)性高、易檢測等優(yōu)點(diǎn),是一種廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)。本研究以楊樹和柳樹的基因組為研究對象,對柳樹全基因組SSR標(biāo)記進(jìn)行開發(fā),為柳樹的分類、遺傳多樣性和進(jìn)化研究提供了豐富的資源。結(jié)合楊樹全基因組SSR標(biāo)記,分別對楊、柳的旁系同源基因和直系同源基因上的SSR標(biāo)記序列進(jìn)行分析,揭示楊、柳分化后基因組的進(jìn)化趨勢。另外,通過已發(fā)表的楊樹SSR引物數(shù)據(jù)庫尋找楊、柳基因組的通用引物,為建立楊、柳大遺傳系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.簸箕柳全基因組共檢索到完全微衛(wèi)星109972個,平均4799bp出現(xiàn)一個完全微衛(wèi)星,在基因間隔區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、外顯子區(qū)和UTR區(qū)微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率分別為:72.8%、19.2%、4.2%和3.8%。對不同類型的微衛(wèi)星的出現(xiàn)頻率進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn):重復(fù)單元長度越長,其微衛(wèi)星含量越少,而重復(fù)單元越短的微衛(wèi)星,獲得重復(fù)單元的速度越快。在柳樹基因組中,不同類型微衛(wèi)星出現(xiàn)的頻率并不是隨機(jī)的,其GC含量與功能具有顯著性相關(guān)。2.將全基因組分為174個窗口,通過劃窗的方法,利用泊松分布檢驗Exonic_SSR在柳樹基因組中的分布情況。結(jié)果顯示67個窗口內(nèi)的SSR分布密集,27個窗口內(nèi)的SSR分布稀疏。SSR分布密集和稀疏的染色體體分別為16號和11號。但密集窗口的總堿基數(shù)只占全基因組的11%,而分散窗口的總堿基數(shù)達(dá)到基因組的55%,由此可見,Exonic_SSR在基因組中并不是均勻分布的,在基因組同源片段中Exonic_SSR大量變異。利用primer3軟件對柳樹基因區(qū)的SSR進(jìn)行引物設(shè)計,為柳樹的進(jìn)化、分類和遺傳多樣性研究提供了豐富的資源。3.分別對楊樹和柳樹旁系同源基因中的SSR標(biāo)記進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)楊樹和柳樹的旁系同源基因主要來源于楊柳科全基因組復(fù)制事件,在進(jìn)化過程中柳樹較楊樹丟失了更多的基因,SSR的變異幅度也較大,說明楊樹和柳樹分化之后,楊樹的基因組較柳樹的基因組穩(wěn)定。4.對楊樹和柳樹直系同源基因內(nèi)的SSR序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)超過50%的SSR只在一個物種中存在。對這些SSR重復(fù)單元進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)A/T組成的重復(fù)單元居多,這與楊柳基因組及CDS區(qū)SSR的特點(diǎn)一致。二者GC含量平均值均為0.22,低于楊樹和柳樹CDS區(qū)域中SSR位點(diǎn)的GC含量,因此,直系同源基因中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定,將導(dǎo)致同源基因繼續(xù)分化。5.通過對毛果楊SSR引物數(shù)據(jù)庫和簸箕柳基因組序列進(jìn)行BlastN比對,獲得楊柳的通用引物8462對。根據(jù)引物的對應(yīng)的序列類型將引物分為三類:(1)通用引物對應(yīng)的柳樹序列中不存在SSR;(2)通用引物對應(yīng)的柳樹序列中存在SSR,且與楊樹SSR重復(fù)序列一致;(3)通用引物對應(yīng)的柳樹序列中存在SSR,但與楊樹SSR重復(fù)序列不同。隨機(jī)選取40對引物在24個簸箕柳自然群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中36對引物(90%)擴(kuò)增成功,結(jié)果表明楊樹的SSR引物在柳樹中具有很高的通用性。對含有SSR序列的第二類和第三類引物進(jìn)行PIC多態(tài)性檢驗,其中22對(29,75.8%)引物具有多態(tài)性,平均PIC分別為30.00%和39.80%,平均每對SSR引物檢測到3.42和3個等位基因,每個SSR引物可檢測到的等位基因數(shù)目為2~7和1~4個不等,共檢測出了71個等位基因。
【圖文】：

圖 3-1 柳樹基因組中外顯子 SSR的分布Fig.3-1 The distribution of exonic SSR in the willow’s gene regions注：最左邊的豎線表示實(shí)際長度，單位Mb；圖中，每條染色體對應(yīng)著兩個柱形圖，左邊柱形圖表示同種顏色為簸箕柳基因同源區(qū)域（白色區(qū)域無同源關(guān)系）；右邊的柱形圖顯示外顯子 SSR 在染色體中的實(shí)際位置。3.2.2 柳樹基因區(qū) SSR 引物設(shè)計利用 Primer 3.0 軟件對柳樹基因區(qū)的 SSR 位點(diǎn)進(jìn)行批量設(shè)計引物，對每個 SSR 位點(diǎn)成功設(shè)計出 4 對引物（SSR 位點(diǎn)總數(shù)為 29850 個）以供選擇，對應(yīng)的左右序列、TM 值以及GC 含量都在表中顯示。3.3 討論通過收集到的簸箕柳基因區(qū)中外顯子 SSR 信息，并利用泊松分布檢驗對其在染色體中分布的疏密情況，這與柳樹全基因組微衛(wèi)星在染色體中的分布（第二章）情況相似。為了更細(xì)致地知曉柳樹染色體上的 exonic_SSR 分布，采用活動的“窗口大小”進(jìn)行檢測。李等[98]利用毛果楊的公共數(shù)據(jù)信息做了關(guān)于 exonic_SSR 在楊樹中的特征分析的研究，更好通過 SSR 的變化，對基因的功能變化做出判斷。楊樹的同源基因中 SSR 的分布與柳樹的結(jié)

第二類中不變 SSR 的基因所含比例分別高于第三類和第四類，也就是說楊樹中不變 SSR 基因數(shù)量的比例要比柳樹要高，以說明楊樹中的 SSR 更加保守，所程中也保留了下來。對每條染色體 SSR 不變的同源基因的基因數(shù)分別統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，參與過全基因組復(fù)樹一號染色體（所含序列堿基數(shù)最多的染色體）所含不變 SSR 的基因數(shù)不是最據(jù)占總基因數(shù)的比例，含有量的是最少的。在楊樹中未見此類情況，，每條染色的同源基因數(shù)與所在染色體的長度線性相關(guān)。.3 SSR 不變的旁系同源基因中 SSR 類型和基序長度分析表 4-3 中對不變 SSR 重復(fù)單元的長度進(jìn)行了統(tǒng)計分析，結(jié)果如下。從SSR 基序第一類中以單堿基重復(fù)SSR（53.4%）的含量最高，其次為二堿基重復(fù) SSR（37類中僅含有單堿基重復(fù)（41.3%）和二堿基重復(fù)SSR（58.7%），第三類則以三R（37.6%）居多，其次為二堿基重復(fù) SSR（30.1%），第四類中二堿基重復(fù) SSR（最高。從 SSR 類型來看，第一類中以單堿基重復(fù)（T）n（27.1%）含量最高，）n（18.6%）的 SSR；第二類中是以（AT）n的 SSR 所占比例最高，38.1%；四類也是以（AT）n的SSR占絕對優(yōu)勢，分別占各類中不變SSR總數(shù)的20.8%和
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S792.11;S792.12

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本文編號：2677915