【摘要】：由橡膠粉孢(Oidium heveae B A. Steinmann,O. heveae)侵染導(dǎo)致的白粉菌是我國橡膠樹的最重要病害,其導(dǎo)致嚴(yán)重的干膠產(chǎn)量損失。O. eveae為專性寄生菌,不能直接進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作,故而其致病分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)迄今比較薄弱,可利用的資料很少。Hog1信號途徑在真菌細(xì)胞中廣泛存在。該途徑是生物體適應(yīng)高滲逆境所必需的,也可能與O.heveae適應(yīng)寄主環(huán)境有關(guān)。本研究從篩選獲得的13個Hog1信號途徑相關(guān)基因中,選取有代表性的OhPbs2和OhCdc42基因,通過同源克隆和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等技術(shù),分別借助橡膠樹炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides,C.gloeosporioides)和稻瘟菌(Magnaporthe grisea,M.grisea)鑒定這兩個基因的功能,為闡明O.heveae對橡膠樹的致病分子機(jī)理提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:1.克隆到13個與Hog1途徑相關(guān)的基因。在O. heveae基因組測序基礎(chǔ)上,通過NCBI比對,采用同源克隆的方法,用Primer 5.0設(shè)計引物后克隆,得到13個Hog1途徑相關(guān)基因,分別命名為:OhHog1、OhPbs2、OhSte11、OhSte50、OhSte20、OhCla4、OhBem1、OhCdc42、OhOpy2、OhYpd1、OhSsk1、OhSsk2/22、OhSho1。2.預(yù)測和驗(yàn)證了OhPbs 基因的功能。利用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,預(yù)測OhPbs2基因編碼蛋白為Pbs2,其功能與菌絲生長、細(xì)胞壁完整性、氧化壓力傳導(dǎo)和高滲透壓甘油合成等生理生化過程有關(guān)。通過同源重組和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將O.heveae 的OhPbs2基因轉(zhuǎn)化到C.gloeosporioides的Pbs2基因缺失突變體△CgPbs2的基因組中,獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子△CgPbs2+OhPbs2。表型比對結(jié)果表明:△CgPbs2不能在高滲透壓的培養(yǎng)基(1.5M山梨醇的PDA平板)環(huán)境下生長,而△CgPbs2+OhPbs2則能正常生長,表明適應(yīng)高滲透壓環(huán)境確實(shí)是OhPbs2基因的功能之一;在常規(guī)培養(yǎng)基、較高濃度的H2O2、較高濃度的SDS (十二烷基硫酸鈉)以及殺菌劑咯菌腈的環(huán)境中,△CgPbs2+OhPbs2的生長發(fā)育表現(xiàn)均與C. gloeosporioides和△CgPbs2有明顯差別,表明OhPbs2基因具有調(diào)控C. gloeosporioides生長發(fā)育、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、菌絲細(xì)胞壁發(fā)育、抵抗殺菌劑逆境等功能;對橡膠樹葉片的致病力測定結(jié)果表明:C.gloeosporioides、△CgPbs2和△CgPbs2+OhPbs2均能誘發(fā)葉片出現(xiàn)典型炭疽病病狀,但 C. gloeosporioides 比△CgPbs2 和△CgPbs2+ OhPbs2 誘發(fā)更重的病害,而△CgPbs2與△CgPbs2+OhPbs2的病害嚴(yán)重程度無顯著差別,表明OhPbs2對C. gloeosporioides致病力的正調(diào)控能力不如CgPbs2。3.預(yù)測和驗(yàn)證了OhCdc4 基因的功能。利用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,預(yù)測OhCdc42基因編碼的是與稻瘟菌類似的Cdc42蛋白,功能與MAPK信號途徑有關(guān)。利用同源重組和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù),將OhCdc42轉(zhuǎn)化到缺失Cdc42的M. grisea突變體△MgCdc42中,獲得互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子△MgCdc42+OhCdc42。表型比對結(jié)果表明:在常規(guī)培養(yǎng)基、高滲透壓以及較高濃度的H2O2等環(huán)境下,△MgCdc42+OhCdc42能長出基本正常的菌落,而Mgrisea突變體△MgCdc42則只能長出微弱的菌落,且前者的菌落大小顯著大于后者,表明OhCdc42基因參與調(diào)控病原菌菌落顏色,且與病菌的滲透壓力和氧化壓力傳導(dǎo)、抵抗殺菌劑逆境等有關(guān);在較高濃度的SDS的環(huán)境中,△MgCdc42+OhCdc42的生長發(fā)育表現(xiàn)均與M.grisea和△MgCdc42沒有明顯差異,但也能夠部分恢復(fù)稻瘟菌耐受SDS的能力。對水稻葉片的致病力測定結(jié)果顯示:M.grisea、△MgCdc42和△MgCdc42+OhCdc42均能誘發(fā)水稻品種C039產(chǎn)生典型的稻瘟病病斑,△MgCdc42+OhCdc42誘發(fā)的病害嚴(yán)重程度與M.grisea無差別,但兩者均顯著高于△MgCdc42誘發(fā)的病害,據(jù)此推斷,OhCdc42基因在病原-寄主互作關(guān)系中,由于在信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用而正調(diào)控了病原菌的致病力。4.分析比對了來自不同地點(diǎn)O.heveae的OhPbs2和OhCdc42基因。分別從海南3個橡膠樹種植地點(diǎn)收集O.heveae,提取DNA,克隆OhPbs2和OhCdc42基因并測序,對序列信息進(jìn)行生物信息和進(jìn)化表達(dá)分析。結(jié)果表明:來自不同地點(diǎn)的OhPbs2和OhCdc42基因,在保守區(qū)域不存在明顯差異。
【圖文】：

并通過一系列信號途徑將信號最終傳遞給轉(zhuǎn)錄因子，激活效應(yīng)蛋白表達(dá)并產(chǎn)生相應(yīng)答反應(yīng)（Ｋｕｍａｍｏｔｏ，２００８）。逡逑在真核生物體內(nèi)存在著許多既彼此獨(dú)立又相互協(xié)作的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)，保證生能夠感受到外界環(huán)境中的變化同時迅速得做出正確的應(yīng)答反應(yīng)（Ｊｕｎｔｔｉｌａｅｔａｌ．，２００８）在這復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)中，有一些普遍存在于生物體內(nèi)且十分保守的信號途徑。其ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ邋ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅｓ）信號途徑主要是通過絲／蘇氨酸蛋白激酶的酸化來調(diào)節(jié)生物體內(nèi)復(fù)雜的生理功能。ＭＡＰＫ信號途徑是由ＭＡＰＫＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）、ＭＡＰＫＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ邋ｋｉｎａｓｅ）和邋ＭＡＰＫ邋（ＭＡＰ邋ｋｉｎａｓｅ）組成的級聯(lián)激酶號途徑，ＭＡＰＫＫＫ－ＭＡＰＫＫ－ＭＡＰＫ是依次被激活的（Ｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。激活的ＭＡＰ進(jìn)一步激活下游的轉(zhuǎn)錄因子以及其它效應(yīng)蛋白，最終生物體對外界特定的環(huán)境信號出正確的應(yīng)答反應(yīng)。ＭＡＰＫ信號途徑之間也是既彼此獨(dú)立又相互協(xié)作的。在植物原真菌中，ＭＡＰＫ信號通路參與了有性生殖、環(huán)境脅迫應(yīng)答、維持細(xì)胞壁完整性致病力等方面的調(diào)控（Ｈａｍｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）。逡逑ＰｈｅｒｏＴ＾ｏｎｅｓ邐Ｎｕｔ＂？ｅｎｔ邐Ｈｉｇｈ邋ｏｓｎｏ邋ａｒｉｔｙ邐Ｃｅｌｌ邋ｗａｉｌ邋ｓｔｒｅｓｓ逡逑

孫雅琦將橡膠樹白粉菌基因組數(shù)據(jù)庫和小麥白粉菌ＱＢｌｔｍｅｒｉａｇｍｍＭｓ）同源序逡逑列比對，獲得２５個ＭＡＰＫ信號途徑相關(guān)基因。利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及聚類分析構(gòu)建橡逡逑膠樹白粉菌中的ＭＡＰＫ級聯(lián)途徑簡圖（圖３），Ｆｕｓ３ａｎｄＫｓｓｌＭＡＰＫ信號途徑有５逡逑個基因，Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ信號途徑有５個基因，其中Ｓｔｅ邋１１、Ｓｔｅ邋５０、Ｃｄｃ邋４２在兩條途徑逡逑中都起作用，屬于功能冗余現(xiàn)象。Ｓｔｉｌ（Ｍｐｋｌ）ＭＡＰＫ信號途徑有６個基因，胞外激逡逑發(fā)ＭＡＰＫ反應(yīng)有５個基因（孫雅琦等，，２０１５）。逡逑通過實(shí)時熒光定量分析，了解ＭＡＰＫ相關(guān)基因在侵染階段的表達(dá)差異情況。結(jié)逡逑合橡膠樹白粉菌在ｐａｒａｆｉｌｍ表面培養(yǎng)０－２４ｈｐｉ（ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）的侵染發(fā)育可大致逡逑歸納為未萌發(fā)（Ｏｈｐｉ）、萌發(fā)（４ｈｐｉ）、附著胞形成（６、８ｈｐｉ）和次生附著胞（１６、逡逑２４ｈｐｉ）等４個形態(tài)發(fā)育階段，研宄發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫ途徑的Ｆｕｓ３邋ａｎｄＫｓｓｌ邋ｐａｔｈｗａｙ在芽管逡逑生成時發(fā)揮主要作用；Ｍｅｋｌ、Ｂｋｋｌ、和奶Ｍ在附著胞形成過程中起主要作用；逡逑在吸器和菌絲形成時，ＭＡＰＫ途徑中的Ｈｏｇｌ邋ＭＡＰＫ邋ｐａｔｈｗａｙ起主要作用（孫雅琦，逡逑２０１５）。逡逑用ＭＡＰＫ信號途徑特異性外源抑制劑－Ｕ０１２６處理，促使橡膠樹白粉菌在非誘導(dǎo)逡逑瓊脂表面萌發(fā)并形成附著胞。研宄發(fā)現(xiàn)ＭＡＰＫ途徑相關(guān)基因參與了邋Ｏ．邋ｈｅｖｅａｅ的萌發(fā)逡逑過程（孫雅琦
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S763.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫雅琦;梁鵬;劉文波;繆衛(wèi)國;鄭服叢;;橡膠樹白粉菌MAPK級聯(lián)信號途徑全基因組鑒定及途徑模型建立[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年12期

2 林舒雅;許文君;;2013年海南省新中農(nóng)場橡膠樹病害調(diào)查初報[J];寧德師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年02期

3 萬三連;梁鵬;宋風(fēng)雅;張宇;劉文波;繆衛(wèi)國;鄭服叢;;橡膠樹白粉病菌分生孢子在不同介質(zhì)的萌發(fā)過程及其內(nèi)容物的變化[J];植物病理學(xué)報;2014年06期

4 毛超;陳平亞;戴青冬;楊臘英;黃俊生;;香蕉枯萎病菌中Hog1 MAPK同源基因FoHog1敲除突變體的生物學(xué)特性[J];微生物學(xué)報;2014年11期

5 萬三連;梁鵬;劉文波;張宇;繆衛(wèi)國;鄭服叢;;橡膠樹與白粉病菌Oidium heveae親和互作組織細(xì)胞學(xué)研究[J];植物保護(hù);2014年03期

6 鞏校東;張曉玉;田蘭;王星懿;李坡;張盼;王s

本文編號：2660944