【摘要】：橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)化酶屬于中堿性轉(zhuǎn)化酶,以蔗糖為唯一底物,是決定產(chǎn)膠細胞乳管蔗糖代謝活性的關鍵酶,其酶活調(diào)控與膠乳產(chǎn)量形成密切相關。在課題組的前期研究中,已證明HbNIN2是主要的膠乳轉(zhuǎn)化酶編碼基因,其基因的表達和酶活調(diào)控與割膠和乙烯刺激產(chǎn)膠密切相關。為進一步研究HbNIN2酶活的分子調(diào)控,筆者以HbNIN2為誘餌,利用酵母雙雜交篩選其互作蛋白,并研究互作蛋白對其酶活的調(diào)控模式。取得的主要結(jié)果如下:1、成功構(gòu)建了橡膠樹膠乳均一化cDNA文庫,并以HbNIN2為誘餌,利用酵母雙雜交篩選到多個候選互作蛋白,其中14-3-3蛋白占陽性克隆總數(shù)的43. 8%;2、利用蓖麻、楊樹、擬南芥等物種的14-3-3蛋白序列,搜索橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫,克隆得到14個橡膠樹14-3-3蛋白基因(HbGF14-1～HbGF14-14),分別屬于ε和non-ε兩個亞型;3、酵母雙雜交驗證結(jié)果表明,14-3-3蛋白僅與主要的膠乳轉(zhuǎn)化酶HbNIN2存在明顯互作,而不與其它四個在膠乳中表達的HbNIIN蛋白發(fā)生互作;4、利用原核(大腸桿菌)表達系統(tǒng),表達并純化出大量帶有組氨酸標簽的可溶性14-3-3蛋白,以及具有酶活的HbNIN2蛋白�；钚詼y定結(jié)果表明,在11個同HbNIN2互作的14-3-3蛋白中,HbGF14-l和HbGF14-12能顯著增強HbNIN2的活性;5、利用真核(畢赤酵母)表達系統(tǒng),誘導表達出帶有組氨酸標簽的HbNIN2蛋白,具有較強的酶活,并進一步利用飽和硫酸銨沉淀獲得大量HbNIN2活性蛋白�；钚詼y定結(jié)果表明,在11種同HbNIN2互作的14-3-3蛋白中,僅HbGF14-l能顯著增強 HbNIN2 的活性,卻有六種(HbGF14-2、HbGF14-4、HbGF14-9、HbGF14-10、HbGF14-13 和 HbGF14-14)顯著抑制 HbNIN2 的酶活。本文研究,首次系統(tǒng)篩選HbNIN2的互作蛋白,并研究主要互作蛋白(14-3-3)基因家族對原核和真核表達的HbNIN2重組蛋白的活性調(diào)控。相關結(jié)果,為深入研究膠乳轉(zhuǎn)化酶活性調(diào)控的分子機理奠定了良好基礎,有助于揭示乳管蔗糖代謝和膠乳再生調(diào)控的分子機制,也為通過分子改良手段提高橡膠樹膠乳產(chǎn)量提供理論依據(jù),兼具理論意義與應用前景。
【圖文】：

３．邋１．邋１膠乳ＲＮＡ的提取與檢測逡逑采用本實驗室改良的膠乳ＲＮＡ提取方法（Ｔａｎｇｅｔａｌ．，２００７），提取膠乳ＲＮＡ。逡逑如圖３．１所示，分別取叫經(jīng)Ｄ巧Ｃ水稀釋１０００倍的膠現(xiàn)ＲＮＡ，汲�。┑媚zs癰鮒馗村義系模盎，

本文編號：2651823