【摘要】：膏桐(Jatropha carcas L.)為大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)植物,是重要的能源樹種,雌花少,雌雄花比例低(1:20)影響產(chǎn)量。皺葉膏桐(Jatropha nigroviensrugosus CV Yang)是新發(fā)現(xiàn)的變種,具有生殖優(yōu)勢,雌雄花比例較高(1:8),進(jìn)行皺葉膏桐成花相關(guān)基因的克隆及分析可以探究皺葉膏桐生殖優(yōu)勢存在的原因。本研究利用Illusima測序技術(shù)針對兩膏桐進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,獲取差異表達(dá)目的基因全長,RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行目的基因不同組織部位的時(shí)空間表達(dá)分析,利用亞細(xì)胞功能定位,雙分子熒光互補(bǔ),轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證等了解基因的具體功能,為膏桐分子育種與栽培生殖調(diào)控提供指導(dǎo)。結(jié)果表明:(1)轉(zhuǎn)錄組文庫測序質(zhì)量良好,Q20在97%以上,Q30在93%以上,QC平均含量在43.5%。皺葉膏桐和膏桐與基因組比對率均在96%以上,序列差異小,親緣關(guān)系接近。GO富集結(jié)果顯示,兩膏桐葉芽對光響應(yīng)上存在著顯著差異;基因表達(dá)趨勢發(fā)現(xiàn),9條基因只在兩膏桐雄花中高表達(dá),雌、雄花中均上調(diào)表達(dá)的基因,多數(shù)為花器官形成相關(guān)基因;兩膏桐的花序芽部位被明顯聚類區(qū)分,差異基因達(dá)1646條。植物激素信號傳導(dǎo)途徑參與了膏桐的性別分化和花芽形成的過程,而DELLA、MYC2、CYCD3等基因可能與皺葉膏桐花序芽形成過程中雄花原基的敗育等過程以及雌花性別的決定相關(guān)。(2)對皺葉膏桐組內(nèi)差異基因富集顯示,與蔗糖磷酸合成酶,可溶性淀粉合成酶(EC:2.4.1.21)和顆粒結(jié)合淀粉合成酶(EC:2.4.1.242)有關(guān)的基因的高表達(dá)可能促進(jìn)了雄花的形成和發(fā)育,基因CUC2和CUC3可能調(diào)節(jié)雌花的形成和發(fā)育�；ㄆ鞴侔l(fā)育的特征基因在四個(gè)組織部位中保守表達(dá),高表達(dá)的均為II型MADS-box基因。(3)共獲得3條差異基因的全長。皺葉膏桐JnCYCD3;1開放閱讀框(ORF)長414bp,編碼137aa,與膏桐相比,存在內(nèi)含子的保留導(dǎo)致編碼框的提前終止,RT-qPCR表明JnCYCD3;1在新生葉的部位的表達(dá)最高,是根部表達(dá)的68.42倍,其次是花序芽,花序芽與雌花形成早期的表達(dá)量無差異,在花粉形成時(shí)期的表達(dá)量最低。皺葉膏桐JnSLR1的ORF長1641bp,編碼546 aa,JnSLR1在花序芽的部位的表達(dá)最高,其次是新葉,在皺葉膏桐雌、雄花之中的表達(dá)量并無差異。皺葉膏桐JnMYC2 ORF 2025bp,編碼674 aa,JnMYC2在花序芽的部位的表達(dá)最高,在皺葉膏桐新葉,雌、雄花之間的表達(dá)量并無差異。(4)啟動子元件分析表明,pJnCYCD3;1具備JA反應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、分生組織表達(dá)相關(guān)元件(CAT-box)、MYB結(jié)合位點(diǎn)參與類黃酮生物合成基因調(diào)控(MBSI)、光反應(yīng)元件(GT1-motif、AAAC-motif)等;pJnSLR1中存在赤霉素響應(yīng)元件TATC-box,MYB、MYC調(diào)控原件,光調(diào)控元件(Box II、Box 4、GT1-motif等)、脅迫響應(yīng)元件等;pJnMYC2基因啟動子中存在CAT-box(與分生組織表達(dá)有關(guān)的順式作用元件),較多的光調(diào)控元件(GT1-motif、G-box、MRE等)、脅迫響應(yīng)元件等。(5)亞細(xì)胞功能定位實(shí)驗(yàn)表明,JnCYCD3;1、JnSLR1均在細(xì)胞核中發(fā)揮功能;JnMYC2可能具備跨核膜行為。(6)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明,JnMYC2與JnCYCD3;1存在互作。(7)JnCYCD3;1轉(zhuǎn)基因煙草能夠明顯的提前生殖周期,可能具有促進(jìn)花形成和轉(zhuǎn)變的作用。
【圖文】：

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生學(xué)位論文產(chǎn)量高（楊成源等，2015）。對皺葉膏桐的引種試驗(yàn)和多年的物候觀察與統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)皺葉膏桐除明顯的葉表型差異外（圖 1-1），兩膏桐開花物候相近，膏桐較皺葉膏桐花期提前一周左右；皺葉膏桐雌雄花比最高可為 1:8，平均為 1:17；而膏桐的最高雌雄比只達(dá) 1:20，，平均雌雄比僅為 1:35。對皺葉膏桐的生殖優(yōu)勢發(fā)生時(shí)期和發(fā)生機(jī)理尚無研究報(bào)道明確指出（何花. 2016），膏桐雌、雄花性別分化的決定機(jī)制也尚未闡明。

圖 1-2 擬南芥開花時(shí)間基因網(wǎng)絡(luò)（Bluemel et al., 2015）Fig1-2. Flowering time gene network of Arabidopsis thaliana (Bluemel et al., 2015)目前在擬南芥中共鑒定出了 180 多個(gè)參與調(diào)控開花的基因，并確定光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑、溫敏途徑和年齡途徑為調(diào)控開花的信號途徑（Fornara et al., 2010）。而在膏桐成花研究相關(guān)中，光周期途徑和赤霉素途徑相關(guān)研究較多。在光周期途徑中，CO，F(xiàn)T 等基因作為光周期的關(guān)鍵調(diào)控因子，發(fā)揮著重要的功能。在擬南芥和膏桐樹種中過表達(dá)膏桐成花相關(guān)同源基因，具有不一樣的功能作用強(qiáng)度，這有可能是物種間的差異所導(dǎo)致的。在對膏桐中的 CO 基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，膏桐的 CO 雖然也具有 B-box 和 CCT 元件，但是不屬于任何雙子葉植物或者單子葉植物植物進(jìn)化枝，可能失去原有的功能，并不直接參與開花調(diào)控（Ohmido et al., 2017）。膏桐的 FT/TFL1 基因家族 6 個(gè)成員的表達(dá)具有
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S794.9

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本文編號：2630037