【摘要】：松材線蟲,學(xué)名Bursaphelechus xylophilus(SteinerBuhrer)Nickle,是目前世界上最具危險性的森林病原之一,由松褐天牛等媒介昆蟲攜帶在林間傳播,引起松樹萎蔫,導(dǎo)致松樹毀滅性死亡。給亞洲許多國家和地區(qū)及北美、歐洲等國家造成了巨大經(jīng)濟損失。自1982年首次在南京發(fā)現(xiàn)以來,該病情在我國迅速蔓延,對我國的森林資源和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞。目前,松材線蟲病防治主要依賴于化學(xué)防治,但高毒性的化學(xué)防治存在成本高、污染大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點,破壞生態(tài)平衡,危害人類健康。因而,采用具有高效、環(huán)保、無污染、不傷害天敵的植物源殺蟲劑防治線蟲病成為近年來研究的熱點和焦點�！盎貧w自然”及農(nóng)藥的無公害化,也是社會和自然科學(xué)發(fā)展的必然趨勢。同時,伴隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的生物分子技術(shù)被用來防治植物寄生線蟲。因此,通過對植物源殺蟲劑殺線機理探討,研究與松材線蟲的生長發(fā)育、侵染寄生、耐藥脅迫、氧化應(yīng)激等相關(guān)基因,尋找新的分子作用靶標(biāo),具有重要意義。insulin/IGF-1 signaling(IIS)路徑是線蟲中先天性免疫系統(tǒng)主要路徑之一,除參與線蟲多爾形成外,在線蟲壽命、脂肪代謝、應(yīng)激反應(yīng)、先天免疫等方面發(fā)揮了重要作用。研究IIS路徑相關(guān)基因功能對尋找新的植物源殺蟲劑作用靶標(biāo)具有重要意義。為了深入研究植物源殺蟲劑對松材線蟲的作用機理,本研究以松材線蟲為研究對象,首次利用高通量測序技術(shù),構(gòu)建了植物源殺線劑處理組(魚藤酮藥劑處理兩個亞致死濃度LC30和LC50)與對照組轉(zhuǎn)錄組,系統(tǒng)分析了殺線劑處理組與對照組間轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因。并篩選出松材線蟲IIS路徑相關(guān)基因,詳細(xì)研究了 IIS路徑中BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-1基因在耐藥應(yīng)激反應(yīng)方面的功能。主要研究結(jié)果如下:1、基于HiSeq 4000高通量測序的植物源殺線劑處理組和對照組轉(zhuǎn)錄組分析。分別構(gòu)建了魚藤酮(LC30=1.35μg/mL、LC50=2.60 μg/mL)和對照(DMSO)處理組松材線蟲混合蟲齡的轉(zhuǎn)錄組文庫,獲得212.87 M Reads,共計69.33 G bp數(shù)據(jù),其中Q30達(dá)到93.27%以上,樣品GC含量平均48.82%。共獲得14115條Unigene。新基因發(fā)掘與分析顯示,共發(fā)掘了 711個新基因。新基因功能注釋顯示,注釋到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG、NR 庫的新基因個數(shù)分別為 25、64、57、114、133、96、169、195個。差異表達(dá)基因分析顯示,魚藤酮(LC30=1.35 μg/mL)處理轉(zhuǎn)錄組與對照轉(zhuǎn)錄組相比,上調(diào)基因151個,下調(diào)基因21個。魚藤酮(LC50=2.60μg/mL)處理轉(zhuǎn)錄組與對照轉(zhuǎn)錄組相比,上調(diào)基因430個,下調(diào)基因184個。差異基因功能注釋和富集分析顯示,注釋到COG、GO、KEGG、NR、Swiss-Prot庫的差異基因個數(shù)分別為189、329、180、511、395個。從注釋基因中鑒別出大量耐藥解毒、氧化應(yīng)激相關(guān)基因,生長發(fā)育、侵染寄生相關(guān)基因,免疫信號通路相關(guān)基因等等,為后續(xù)開展功能基因研究及尋找新的藥物靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。2、松材線蟲IIS路徑相關(guān)基因的CDS克隆與基因分析根據(jù)轉(zhuǎn)錄組篩選鑒定,通過RT-PCR克隆得到了IIS路徑中四個基因BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1。(1)松材線蟲BxDaf-16基因CDS全長為1533bp,編碼510個氨基酸,相對分子質(zhì)量為57.95 kDa,理論等電點為6.55。無信號肽及跨膜區(qū)域存在。序列分析顯示BxDaf-16包含6個DNA結(jié)合位點,1個Forkhead保守結(jié)構(gòu)域,屬于FOXO轉(zhuǎn)錄因子家族。(2)松材線蟲BxAge-1基因CDS全長1539 bp,編碼512個氨基酸,相對分子質(zhì)量為60.14 kDa,理論等電點為7.22。無信號肽及跨膜區(qū)域存在。序列分析顯示BxAge-1含有“TEL1”保守結(jié)構(gòu)域,屬于PKc_like超家族。(3)松材線蟲BxAkt基因CDS全長為1707 bp,編碼568個氨基酸,相對分子質(zhì)量為65.54 kDa,理論等電點為5.63。無跨膜區(qū)及信號肽存在。蛋白序列分析顯示BxAkt含有11個磷酸肌醇結(jié)合位點及19個ATP結(jié)合位點,具有“PH”與“S_TKc”兩個保守結(jié)構(gòu)域,屬于“PH-like”超家族及“PKc_like”家族。(4)松材線蟲BxSgk-1基因CDS全長為1281 bp,編碼426個氨基酸,蛋白相對分子量為49.90 kDa,理論等電點為8.79。無信號肽及跨膜區(qū)域存在。蛋白序列分析顯示BxSgk-1含有19個ATP結(jié)合位點,具有“STKc__SGK”保守結(jié)構(gòu)域,屬于PKc_like超家族。蛋白比對分析顯示,松材線蟲BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1蛋白與其它線蟲的同源蛋白間高度保守。3、松材線蟲IIS路徑相關(guān)基因的表達(dá)分析利用原位雜交技術(shù),對四個基因在松材線蟲中的組織表達(dá)進(jìn)行定位分析,顯微觀察顯示:BxDaf16基因主要在雄蟲的咽部神經(jīng)環(huán)與中腸道處表達(dá),在雌蟲的頭部神經(jīng)元與卵巢處表達(dá);BxAge-1基因在松材線蟲雌雄蟲間的組織表達(dá)略有差異,主要在線蟲的生殖部位附近表達(dá);BxAkt基因在線蟲雌雄蟲間表達(dá)略有差異,主要在雄蟲的生殖部位、肛門神經(jīng)部位及咽部神經(jīng)部位表達(dá),在雌蟲的咽部神經(jīng)周圍處表達(dá);BxSgk-1基因主要在線蟲雄蟲的的背部神經(jīng)脊索處表達(dá),在雌蟲的咽前部周圍神經(jīng)及中食道球后部神經(jīng)附近表達(dá)。利用qPCR法,對四個基因在魚藤酮、苦參堿及鹽酸左旋咪唑藥劑脅迫處理時的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。定量結(jié)果顯示:3種藥劑脅迫12 h及24 h時,BxDaf16基因表達(dá)均上調(diào),推測BxDaf16基因在松材線蟲耐藥應(yīng)激中起到正向調(diào)控作用;BxAge-1基因在低濃度的鹽酸左旋咪唑藥劑脅迫時的表達(dá)呈下降趨勢,而在魚藤酮及苦參堿藥劑脅迫時的表達(dá)規(guī)律不明顯;BxAkt基因在苦參堿及鹽酸左旋咪唑脅迫12 h時的表達(dá)下降,在其他處理時的表達(dá)變化不規(guī)律;BxSgk-1基因在鹽酸左旋咪唑脅迫12 h時的相對表達(dá)下降,而在其它處理時的表達(dá)總體上調(diào)。BxAge-1、BxAkt、BxSgk-1三種激酶基因均與松材線蟲的耐藥應(yīng)激、免疫防御密切相關(guān)�？傊�,作為重要的潛在藥物靶標(biāo)基因,松材線蟲IIS路徑中四個基因是殺線機理研究與未來新型殺線劑研究的重點。4、松材線蟲IIS路徑相關(guān)基因的RNAi體外合成BxDaf-16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-1四個靶標(biāo)基因的dsRNA,利用體外浸泡法進(jìn)行RNA沉默試驗。qPCR檢測沉默效果,同時進(jìn)行魚藤酮、苦參堿及鹽酸左旋咪唑藥劑脅迫處理實驗,觀察dsRNA處理組與DEPC-H2O處理組間的線蟲死亡率變化,研究四個基因在線蟲應(yīng)激、免疫防御方面的具體功能。qPCR結(jié)果表明:dsRNA處理后松材線蟲與對照組線蟲相比,BxDaf16、BxAge-1、BxAkt及BxSgk-及基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降,沉默效率分別為40.13%、48.18%、68.87%、38.30%。表型觀察顯示:與對照組線蟲相比,dsBxDaf-16處理的線蟲表型呈“蜷縮打結(jié)”,擺動頻率明顯下降;dsBxAge-1處理的線蟲表型及擺動頻率無明顯差異;dsBxAkt處理的線蟲表型無明顯差異,成蟲的擺動頻率下降;dsBxSgk-1處理組的線蟲表型無明顯差異,線蟲擺動頻率明顯下降。生測試驗結(jié)果顯示:與對照處理的線蟲相比,dsBxDaf-16處理的線蟲在3種藥劑脅迫12 h及24 h時的死亡率明顯增加。dsBxAge-1處理的線蟲在3種藥劑脅迫12 h及24 h時的死亡率總體下降。dsBxAkt處理的線蟲除在魚藤酮藥劑脅迫12 h時的死亡率明顯上調(diào)外,在其它藥劑處理時的死亡率總體下降。dsBxSgk-1處理的線蟲除在苦參堿藥劑脅迫24 h時的死亡率明顯上調(diào)外,在其它藥劑脅迫處理時的死亡率顯著下降。5、松材線蟲IIS路徑中四個基因聯(lián)合沉默初步探究在四個基因單獨沉默的基礎(chǔ)上,采用體外浸泡dsRNA法進(jìn)行基因聯(lián)合沉默干擾試驗。結(jié)合qPCR、生測試驗等方法,系統(tǒng)研究了四個基因在松材線蟲耐藥脅迫及免疫防御防御的功能,初步探究松材線蟲IIS路徑中四個基因間的基因關(guān)系。qPCR結(jié)果顯示:BxDaf-16與BxAge-1共沉默、BxDaf-16與BxAkt共沉默、BxDaf-16與BxSgk-1共沉默、BxAge-1與BxAkt共沉默、BxAge-1與BxSgk-1共沉默、BxAkt與BxSgk-1共沉默后的靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平均下降,基因聯(lián)合沉默成功。藥劑處理試驗顯示:與BxDaf-16基因單獨沉默相比,BxDaf-16與BxAge-1基因共沉默、BxDaf16與BxAkt基因共沉默、BxDaf-16與BxSgk-1基因共沉默的線蟲,在藥劑脅迫時的死亡率總體下降。BxAge-1與BxAkt基因共沉默、BxAge-1與BxSgk-1基因共沉默、BxAkt與BxSgk-1基因共沉默的線蟲,在不同藥劑脅迫時死亡率變化不規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S763.18

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2617329