【摘要】：傳粉滴(Pollination drops,PD),是裸子植物胚珠產(chǎn)生的分泌物。傳粉滴參與花粉捕獲、萌發(fā)和受精過(guò)程,是大多數(shù)裸子植物傳粉系統(tǒng)的重要組成部分。前人對(duì)裸子植物傳粉滴的分泌和功能已有較為深入的研究,然而對(duì)于傳粉滴中的化學(xué)成分以及分泌的分子機(jī)制研究則較少。此外,在動(dòng)物的外泌體中檢測(cè)到miRNAs,稱為細(xì)胞外miRNA(Extracellular miRNAs),但植物中是否也存在ExtracellularmiRNAs尚未有報(bào)道。本研究以銀杏傳粉滴為研究對(duì)象,通過(guò)高通量sRNA測(cè)序和GS-MS技術(shù),檢測(cè)出傳粉滴中含有大量代謝產(chǎn)物,并鑒定到miRNAs。進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、小RNA組學(xué)及分子生物學(xué)等,探究參與調(diào)控傳粉滴分泌的分子機(jī)制,主要取得以下結(jié)果:(1)銀杏傳粉滴中的成分主要為糖,包括葡萄糖等單糖,以及蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖,共23種,占總物質(zhì)45.70%;其次為有機(jī)酸,包括葡庚糖酸、丙酮酸、乳酸等共18種,占15.94%;木糖醇、山梨醇和肌醇等13種醇類,占15.39%;以及類黃酮和萜類等次生代謝物共19種,占11.94%。這些代謝產(chǎn)物主要參與半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等通路。(2)采用稀釋后的傳粉滴培養(yǎng)銀杏花粉,培養(yǎng)24 h后花粉脫外壁,48 h后,部分花粉開始萌發(fā)產(chǎn)生花粉管,說(shuō)明銀杏傳粉滴中含有促進(jìn)花粉萌發(fā)的物質(zhì)。根據(jù)傳粉滴成分,進(jìn)一步配置分別添巖藻糖、麥芽糖、山梨糖,以及按傳粉滴中蔗糖、葡萄糖和果糖比例配置的培養(yǎng)基進(jìn)行花粉培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),花粉雖可吸水膨脹且積累淀粉粒,但均未萌發(fā)形成花粉管,表明不同于被子植物和其他裸子植物,銀杏花粉萌發(fā)難,時(shí)間長(zhǎng),須在傳粉滴的條件下才能正常萌發(fā)生長(zhǎng),但傳粉滴中具體哪些成分是花粉管萌發(fā)生長(zhǎng)的必須物質(zhì)尚需要進(jìn)一步深入研究。(3)采用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)銀杏花粉,48 h天后開始染菌;根據(jù)傳粉滴成分添加綠原酸后,96 h天后部分染菌;而添加月桂酸、乳酸和馬來(lái)酸的培養(yǎng)基可顯著抑制污染。OD600數(shù)據(jù)分析同樣顯示乳酸、馬來(lái)酸和月桂酸單甘油酯的數(shù)值較低,表明銀杏傳粉滴中的月桂酸、乳酸和馬來(lái)酸在花粉離體培養(yǎng)中具有顯著抑菌功能。(4)傳粉滴小RNA測(cè)序分析,共檢測(cè)到45個(gè)已知miRNAs和550個(gè)新的miRNAs。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證4個(gè)已知miRNAs在傳粉滴中有表達(dá),表明傳粉滴中存在miRNAs。潛在靶點(diǎn)分析表明,miRNAs可能參與碳水化合物代謝、激素信號(hào)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和防御反應(yīng)等,這些功能與代謝組學(xué)結(jié)果一致。進(jìn)一步比較傳粉滴和胚珠中miRNAs的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),幾乎所有傳粉滴中已知的miRNAs都在胚珠中表達(dá),且有些miRNAs的表達(dá)量高于胚珠,暗示著傳粉滴中的miRNAs一部分可能來(lái)源于胚珠。(5)傳粉前后胚珠高通量測(cè)序鑒定到可能與分泌相關(guān)的差異基因Gb_23187,以及與淀粉代謝相關(guān)的差異基因,如Gb_32465、Gb_05693和Gb_28387,在授粉后表達(dá)量均下調(diào)。小RNA組學(xué)分析進(jìn)一步明確了 miR1083、miR858b和miR858a可能參與調(diào)控分泌,而ptc-miR319i、miR159f、miR166d-5p 等 12 個(gè) miRNAs 可能參與調(diào)控淀粉代謝。(6)傳粉滴分泌旺盛期,赤霉素信號(hào)通路中的基因Gb_11704和赤霉素合成相關(guān)的基因Gb_05787、Gb_16591等上調(diào)表達(dá);茉莉酸信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控基因Gb_17431和Gb_17432下調(diào)表達(dá),而Gb_39942、Gb_03931、Gb_18696等與茉莉酸合成相關(guān)的差異基因均上調(diào)表達(dá)。外源噴施試驗(yàn)進(jìn)一步證明100 μM茉莉酸甲酯和短時(shí)間的赤霉素處理均可有效促進(jìn)傳粉滴的分泌,說(shuō)明茉莉酸和赤霉素可能參與調(diào)控銀杏傳粉滴的分泌。(7)通過(guò)與其他物種中的分泌基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析,鑒定到一些可能參與銀杏胚珠分泌的基因,包括Gb_15814、Gb_19348和Gb_23187,qRT-PCR顯示,3個(gè)基因在傳粉滴分泌期上調(diào)表達(dá),而在授粉后表達(dá)量下降。進(jìn)一步克隆這些基因并構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草,激光共聚焦顯微鏡下可觀察到Gb_15814、Gb_19348主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜中,而Gb_23187在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核中均有定位。關(guān)于這三個(gè)可能與分泌相關(guān)的基因的功能驗(yàn)證尚需進(jìn)一步深入研究。
【圖文】：

圖１技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｅ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑

第三章結(jié)果與分析逡逑３．１銀杏傳粉滴成分分析逡逑為檢測(cè)銀杏傳粉滴中的成分，采集帶有胚珠的銀杏枝條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室水培（圖３－ｌａ，，邋ｂ），逡逑至傳粉滴的體積達(dá)到最大時(shí)（圖３－１邋ｃ，ｄ），使用移液槍收集至２００邋ｐＬ的離心管中（圖３－１邋ｅ）。逡逑＇Ｖ１邐；逡逑Ｉ邋Ｐｔｉｙ邐Ｉ逡逑：Ａ邋—．邐！逡逑邐邋： 邐：邐ｒｙ：邐，逡逑圖３－１銀杏傳粉滴的收集逡逑（ａ）試驗(yàn)田中帶有胚珠的銀杏枝條；（ｂ）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)水培銀杏枝條；（ｃ，ｄ）銀杏傳粉滴的分泌；（ｅ）銀杏傳粉逡逑滴采集模式圖．ＯＶ：胚珠；ＰＤ：傳粉滴逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐｓ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ逡逑（ａ）邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ邋ｂｒａｎｃｈｅｓ邋ｗｉｔｈ邋ｏｖｕｌｅｓ；邋（ｂ）邋Ｈｙｄｒｏｐｏｎｉｃ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ邋ｂｒａｎｃｈｅｓ邋ｉｎ邋ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；邋（ｃ，邋ｄ）邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ逡逑ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐｓ；邋（ｅ）邋Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ邋ＰＤｓ邋ｏｆ邋Ｇ．邋ｂｉｌｏｂａ．邋ＯＶ：邋Ｏｖｕｌｅ；邋ＰＤ：邋ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｒｏｐ逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S792.95

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本文編號(hào)：2615237