【摘要】：銅離子在生物體內(nèi)具有重要作用,缺銅會影響生物體生長發(fā)育,但是過量的銅離子也具有潛在毒性,生物體在進化過程中形成了復(fù)雜的調(diào)控機制確保細胞內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)。此外,進入細胞的銅離子會被蛋白質(zhì)和小分子配體螯合,這些銅離子的轉(zhuǎn)運是通過銅伴侶蛋白完成的。本研究利用已經(jīng)克隆的小黑楊銅伴侶蛋白基因PnATX1和PnATX2,通過Gateway方法構(gòu)建RNAi表達載體,遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊后獲得了轉(zhuǎn)基因株系。PCR方法獲得小黑楊PnATXs啟動子的缺失序列后,構(gòu)建了缺失序列與GUS基因的融合表達載體并遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥;GUS染色初步確定了PnATX1和PnATX2啟動子缺失序列的生物學(xué)活性。以PnATXs過表達小黑楊株系為試材,測定了轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在銅脅迫處理條件下的生理生化指標(biāo)。主要研究結(jié)果如下:(1)利用Gateway方法,通過BP反應(yīng)和LR反應(yīng)成功構(gòu)建了小黑楊PnATXs基因的RNAi表達載體,電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞后獲得了含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株。通過葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化小黑楊后獲得了 10個PnATX1-RNAi和6個PnATX2-RNAi抗性株系。PCR及qRT-PCR鑒定結(jié)果顯示,獲得的小黑楊PnATX1和PnATX2的RNAi株系中PnATX1、PnATX2基因的表達量受抑制程度存在差異。與野生型植株相比,PnATX1-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中,3、5、9號地上部PnATX1基因的表達量顯著降低,10號轉(zhuǎn)基因株系根和地上部PnATX1基因的表達量均顯著下降;PnATX2-RNAi株系中,2、3、4、5、6號的地上部PnATX2基因的表達量顯著降低。(2)利用PnATX全長啟動子序列設(shè)計引物,并通過PCR方法分別獲得了PnATX1和PnATX2啟動子的3段缺失序列(PnATX1-1、PnATX1-2、PnATX1-3和PnATX2-1、PnATX2-2、PnATX-3)。利用啟動子缺失片段替換植物表達載體pBI121的35S啟動子后與GUS基因構(gòu)建融合表達載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株。T2代轉(zhuǎn)化植株的GUS染色結(jié)果表明,PnATX1-3和PnATX2-3啟動子缺失序列具有啟動功能,而PnATX1-1、PnATX1-2、PnATX2-1和PnATX2-2啟動子缺失序列不能啟動報告基因GUS表達。利用缺銅和含有不同銅離子濃度(5 μmoL/L和50μmoL/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)擬南芥T2代轉(zhuǎn)化株系,組織化學(xué)染色結(jié)果表明,PnATX1-3和PnATX2-3啟動子缺失序列轉(zhuǎn)化的擬南芥中GUS基因的表達不受銅離子濃度影響。小黑楊PnATX1和PnATX2啟動子不同缺失片段應(yīng)答銅離子脅迫的具體機制尚需進一步試驗驗證。(3)在缺銅、正常銅離子濃度和高濃度銅離子條件下處理小黑楊野生型植株、小黑楊PnATX1過表達株系2、3、5號及PnATX2過表達株系1、2、5號,并測定處理植株的根長、株高、葉面積、葉綠素含量、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)酶活及丙二醛(MDA)含量。缺銅、正常銅濃度和高濃度銅離子處理后,小黑楊野生型植株和PnATX過表達植株的株高和葉面積無明顯差異。與野生型植株相比,缺銅和正常銅濃度處理后PnATXs乃過表達植株的根長無顯著變化,10μmol/L Cu2+處理后,PnATX1過表達3號和5號株系根長顯著增加;15μmol/L Cu2+處理后PnATX1過表達3號、5號株系和PnAX2過表達5號株系的根長顯著增加;高濃度銅離子處理后小黑楊PnATX1和PnATX2過表達植株的葉綠素含量顯著高于野生型植株。丙二醛含量測定結(jié)果表明,與野生型植株相比,3號PnATX1過表達株系和1號PnATX2過表達株系應(yīng)答缺銅處理幼葉的丙二醛含量顯著降低,而其他轉(zhuǎn)基因株系幼葉和成熟葉片丙二醛含量在正常銅濃度和缺銅處理后無明顯變化。高濃度銅離子處理后,尤其是15 μmol/L銅離子處理后,小黑楊PnATX1和PnATX2過表達植株的幼葉和成熟葉片SOD活性顯著高于野生型植株。此外,10 μmol/L和15 μmol/L CuSO4處理后,PnATX1過表達2號轉(zhuǎn)基因株系成熟葉片POD活性、PnATX1過表達5號轉(zhuǎn)基因株系和PnATX2過表達5號轉(zhuǎn)基因株系幼葉CAT活性與野生型植株無顯著差異,其余各轉(zhuǎn)基因小黑楊植株幼葉和成熟葉片的過氧化物酶及過氧化氫酶活性均顯著高于野生型植株。這些工作為更深入地闡明小黑楊銅伴侶蛋白PnATX1和PnATX2的生物學(xué)功能及其在維持楊樹細胞銅穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮的具體功能奠定了試驗基礎(chǔ)。
【圖文】：

２．３．１小黑楊尸／＾ｍ基因ＲＮＡｉ表達載體的構(gòu)建逡逑用尸Ｗ７Ｘｓ－ＲＮＡｉ－Ｆｌ和ＰＷ７＾－ＲＮＡｉ－Ｒｌ引物進行質(zhì)粒ＰＣＲ，擴增和逡逑基因的用于構(gòu)建ＲＮＡｉ載體的目的條帶。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖２－１所逡逑示，成功擴增了長度為１４５邋ｂｐ和１４１邋ｂｐ的Ｊ７Ｘ／－ＲＮＡｉ及ｄ７Ｘ２－ＲＮＡｉ目的條帶。逡逑Ｍ邐１邐２逡逑ｔ悘媝：逡逑圖２－１邋Ｐ／ＭＴ＾－ＲＮＡｉ目的條帶的ＰＣＲ擴增結(jié)果逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｐｄｒａ－ＲｌＮＡｉ邋目的條帶；２：邋ＰＨｊｒａ－ＲＮＡｉ邋目的條帶。逡逑利用高保真ＤＮＡ聚合酶ＫＯＤ和ａｔｔＢ引物，采用兩步ＰＣＲ法在Ｐ以７Ｘｙ－ＲＮＡｉ目逡逑的條帶的兩端引入加成位點。第一次ＰＣＲ完成后純化擴增產(chǎn)物進行第二次ＰＣＲ擴增。逡逑純化ＰＣＲ擴增產(chǎn)物。擴增條帶純化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示（圖２－２Ａ，逡逑Ｂ），加入了如重組位點的Ｐｉ＾ｒＡ－ＲＮＡｉ目的條帶的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物純化成功，可以用逡逑于ＢＰ反應(yīng)。逡逑－１４邋－逡逑

Ａ：邋Ｐ／；／ｉｍ－ＲＮＡｉ目的條帶連接部分位點的ＰＣＲ純化產(chǎn)物；Ｂ：含有完整《？５位點的逡逑／ＷＪ７Ｘｖ－ＲＮＡｉ目的條帶的ＰＣＲ純化產(chǎn)物。逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｐ／Ｉ／４７Ｘ７－ＲＮＡＩ邋條帶；２：邋／＞／ｔ４７Ｘ２－ＲＮＡｉ邋條帶。逡逑利用含有ａｔｔＢ位點的／＾７Ｘｓ－ＲＮＡｉ目的條帶與ｐＤＯＮＲ？載體進行ＢＰ反應(yīng)，獲得逡逑ｅｎｔｒｙ載體。將ｅｎｔｒｙ載體轉(zhuǎn)化ＴｒａｎｓＴｌ－１感受態(tài)細胞，，在含有卡那霉素的平板上篩選陽逡逑性克隆。將陽性克隆擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用也引物對質(zhì)粒進行ＰＣＲ擴增檢測。擴逡逑增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖２－３所示，Ｐ＾ｒ＾－ＲＮＡｉ目的條帶的ｅｎｔｒｙ載體逡逑均可擴增出預(yù)期大小的目的片段，由此表明，Ｐ＾７＾－ＲＮＡｉ目的條帶的ｅｎｔｒｙ載體構(gòu)建逡逑成功，可以進行ＬＲ反應(yīng)。逡逑Ｍ１邋２３４５６７８逡逑ＺｉＭｉＯｂｐ逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S792.11

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Vincent L.Chiang;;Conservation and Diversity of MicroRNA-associated Copper-regulatory Networks in Populus trichocarpa[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 徐進;馬鈴薯StSUT2基因干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化[D];蘭州理工大學(xué);2017年

本文編號：2612492