本文關鍵詞：幾種臨床常見致病菌的全基因組序列測定及分析

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【摘要】：近年來,隨著臨床上抗生素的廣泛使用耐藥菌株的出現(xiàn),細菌的抗生素耐藥和尋找新的藥物作用靶位點日益成為一個國際性課題,美國疾病控制和預防中心(CDC)和世界衛(wèi)生組織(WHO)在各自的調(diào)查報告中一致認為在可以預見的未來細菌耐藥將是人類公共健康領域最具威脅的一方面。在國內(nèi),臨床上多重耐藥、廣泛耐藥和全耐藥的菌株不斷被發(fā)現(xiàn)且日益增多,為細菌所致感染的治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)；細菌全基因組測序可以應用于臨床細菌感染的檢測、細菌耐藥等研究,隨著測序技術尤其第二代測序技術的快速發(fā)展,細菌全基因組測序成本的降低和測序時間的縮短,為細菌導致的院內(nèi)感染提供了新的研究方法和工具。本研究為了探究我國臨床常見致病菌的基因組結構、組成以及耐藥信息,為臨床上細菌診斷與感染后用藥提供指導；利用第二代測序技術Ion TorrentPGM或Illumina Hiseq2500測序平臺結合PacBio RSII第三代測序平臺,獲取從臨床分離得到的常見致病菌的全基因組序列信息,并利用生物信息學方法對基因組進行常規(guī)信息學分析,此外對阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)進行了耐藥基因分析等個性化分析。試驗所用細菌均來自協(xié)和醫(yī)院檢驗科,主要有阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)(接收號：CP014993)、鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CGl)、銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CGl)、金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1);通過Ion Torrent PGM測序平臺或Illumina Hiseq2500測序平臺與PacBio RSII測序平臺獲得全基因組的完成圖,阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)基因組大小為4,648,696bp, GC含量為55.76%,采用Glimmer對全基因組進行基因模型預測有4790編碼基因：鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CG1)基因組大小為3,934,081bp, GC含量為39.11%,采用Glimmer對全基因組進行基因模型預測有3718個基因；銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CG1)基因組大小為6,455,664bp, GC含量為66.42%,采用Glimmer對全基因組進行基因模型預測有5911個基因；金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1)基因組大小為2,779,781bp, GC含量為32.91%,采用Glimmer對全基因組進行基因模型預測有2561個基因；本實驗還對阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)進行Biolog耐藥檢測試驗和從基因水平進行細菌耐藥的預測等,阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)對新生霉素、多黏菌素、羧芐青霉素高度敏感,對新霉素、卡那霉素、頭孢菌素等具有耐藥性；通過與ARDB數(shù)據(jù)庫比對,阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)基因組中有52個基因與細菌的耐藥相關,這些基因包括qnrB、gyrA等。
【關鍵詞】：耐藥菌 全基因組測序 高通量測序
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R440;R378
【目錄】：

• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 第一章 引言10-20
• 1.1 細菌導致院內(nèi)感染及耐藥現(xiàn)狀10-11
• 1.2 我國細菌引起的院內(nèi)感染及耐藥現(xiàn)狀11-13
• 1.3 細菌的耐藥機制與基因間的關系13
• 1.4 基因組測序在細菌臨床檢測及耐藥研究中的應用13-18
• 1.4.1 測序技術簡介14-16
• 1.4.2 全基因組測序在細菌鑒定、耐藥、新藥研發(fā)的應用16-18
• 1.4.3 各國微生物基因組計劃18
• 1.5 本章小結18-19
• 1.6 本文研究內(nèi)容19-20
• 第二章 實驗材料與方法20-46
• 2.1 實驗材料20-22
• 2.1.1 主要實驗設備20-21
• 2.1.2 主要實驗試劑21-22
• 2.2 實驗方法22-46
• 2.2.1 細菌培養(yǎng)、凍存、復蘇22-23
• 2.2.2 細菌基因組提取及16s rDNA鑒定23
• 2.2.3 BioLog菌種鑒定23-24
• 2.2.4 BioLog細菌藥物敏感性檢測24-25
• 2.2.5 Ion Torrent文庫構建25-28
• 2.2.6 Ion Torrent測序準備試驗28-35
• 2.2.7 Hiseq文庫構建35-38
• 2.2.8 Hiseq測序準備試驗38-39
• 2.2.9 PacBio文庫構建39-44
• 2.2.10 PacBio測序準備試驗44
• 2.2.11 數(shù)據(jù)分析44-45
• 2.2.12 PCR驗證基因組序列45-46
• 第三章 實驗結果46-79
• 3.1 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)46-63
• 3.1.1 核酸提取及16s rDNA鑒定46-47
• 3.1.2 BioLog菌種鑒定47-49
• 3.1.3 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)BioLog藥敏檢測結果49-55
• 3.1.4 Ion torrent文庫建立55
• 3.1.5 Ion torrent高通量測序結果55-56
• 3.1.6 Ion Torrent測序結果拼接及PCR測序56-61
• 3.1.7 PacBio文庫建立61-62
• 3.1.8 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)PacBio測序結果62-63
• 3.2 銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CG1)63-67
• 3.2.1 核酸提取及16s rDNA鑒定63-64
• 3.2.2 BioLog菌種鑒定64-65
• 3.2.3 Ion torrent文庫建立65-66
• 3.2.4 Ion torrent高通量測序結果66
• 3.2.5 PacBio文庫建立66-67
• 3.2.6 銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CG1)PacBio測序結果67
• 3.3 鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CG1)67-73
• 3.3.1 核酸提取及16s rDNA鑒定67-69
• 3.3.2 BioLog菌種鑒定69-70
• 3.3.3 Hiseq文庫建立70-71
• 3.3.4 Hiseq高通量測序結果71-72
• 3.3.5 PacBio文庫建立72
• 3.3.6 鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CG1)PacBio測序結果72-73
• 3.4 金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1)73-79
• 3.4.1 核酸提取及16s rDNA鑒定73-74
• 3.4.2 BioLog菌種鑒定74-75
• 3.4.3 Hiseq文庫建立75-76
• 3.4.4 Hiseq高通量測序結果76
• 3.4.5 PacBio文庫建立76-77
• 3.4.6 金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1)PacBio測序結果77-79
• 第四章 數(shù)據(jù)分析79-97
• 4.1 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)79-88
• 4.1.1 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)基因組基本信息79
• 4.1.2 基因組基本結構79-80
• 4.1.3 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)進化分析80-83
• 4.1.4 一般生物信息學分析83-85
• 4.1.5 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)(ARDB)耐藥基因注釋85-87
• 4.1.6 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)BioLog耐藥分析87-88
• 4.2 銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CG1)88-91
• 4.2.1 銅綠假單胞菌(PAIPBJ-CG1)基因組基本信息88-89
• 4.2.2 基因組基本結構89
• 4.2.3 一般生物信息學分析89-91
• 4.3 鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CG1)91-94
• 4.3.1 鮑曼不動桿菌(BOIPBJ-CG1)基因組基本信息91
• 4.3.2 基因組基本結構91-92
• 4.3.3 一般生物信息學分析92-94
• 4.4 金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1)94-97
• 4.4.1 金黃色葡萄球菌(SAIPBJ-CG1)基因組基本信息94
• 4.4.2 基因組基本結構94
• 4.4.3 一般生物信息學分析94-97
• 第五章 討論97-103
• 5.1 基于生化反應的Biolog菌種鑒定結果與基于保守基因鑒定結果差異分析97-98
• 5.2 阿氏腸桿菌(ENIPBJ-CG1)的耐藥分析結果討論98-99
• 5.3 應急檢測中基因組測序策略選擇99-103
• 參考文獻103-110
• 發(fā)表文章110-111
• 致謝111-112
• 附錄112-131

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本文編號：803267